軟骨作為硫酸軟骨素的生產(chǎn)原料，其來(lái)源也是生產(chǎn)廠家和消費(fèi)者關(guān)心的重點(diǎn)。軟骨中有多少DNA？能不能提出來(lái)？如何鑒定其來(lái)源？請(qǐng)看下面的實(shí)驗(yàn)。

一、實(shí)驗(yàn)材料：

干燥的豬鼻骨

二、實(shí)驗(yàn)試劑：

動(dòng)物組織DNA試劑盒（simgen，Cat.No.3101050）、Buffer SP、豬源DNA基因檢測(cè)試劑盒（simgen，Cat.No.7804050）

三、實(shí)驗(yàn)設(shè)備：

水浴鍋、高速離心機(jī)、移液器、微量紫外分光光度計(jì)及熒光PCR儀

四、實(shí)驗(yàn)方法：

1) 用全新的手術(shù)刀刮去軟骨有霉變的表層，用刀尖切取中間部分，裝到1.5 ml離心管（每管15-25 mg左右）中；

2) 向樣本中加入20μl蛋白酶K貯存液，180μl 的Buffer AT和15μl的Buffer SP。

3) 56℃水浴至軟骨完全溶解（約30 min），溶液呈透明狀；

4) 加入200μl Buffer SL，旋渦震蕩15 s混勻，70℃水浴10 min；

5) 加入200μl無(wú)水乙醇，溫和翻轉(zhuǎn)離心管4-6次，低速離心將管蓋上的液體離下來(lái)。

6) 將上一步驟的液體轉(zhuǎn)移到核酸純化柱，12000 rpm離心30 s；

7) 加入Buffer WA和Buffer WB各洗滌一次；

8) 13000 rpm空離2 min；

9) 加入80μl Buffer TE洗脫DNA；

10) 在紫外分光光度計(jì)上測(cè)量DNA的濃度；

11) 瓊脂糖凝膠電泳；

使用4μl DNA模板進(jìn)行熒光定量PCR豬源檢測(cè)。

五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1．在微量紫外分光光度計(jì)上用Buffer TE調(diào)零，測(cè)量洗脫下來(lái)的軟骨DNA濃度，結(jié)果如下，

從測(cè)量的OD值來(lái)看，樣品濃度很高，從25mg的軟骨中可以提到8μg的DNA，OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.75-1.78之間，DNA純度很高，估計(jì)是因?yàn)楦稍锖蟮能浌墙?jīng)一段時(shí)間的保藏和運(yùn)輸，其中的RNA早已被降解完全。不過(guò)放了這么久，DNA可能也會(huì)有很大程度的降解，降解的短核苷酸鏈也會(huì)有提高OD₂₆₀吸收值的作用，所以我們來(lái)跑電泳看一下有沒有基因組DNA的主條帶。

2．在1%的瓊脂糖凝膠上，加入8μl軟骨DNA，電泳15min，結(jié)果如下，

出乎我們的意料，雖然可以看到部分拖尾的降解條帶，但是電泳主條帶也非常清晰。說(shuō)明我們從軟骨樣本中提到了完整度很高的基因組DNA，并且含量也不低。至于為什么能從軟骨中提到這么完整的DNA，推測(cè)有可能是因?yàn)檐浌墙?jīng)干燥以后，各種酶相繼失活，DNA反而得到了很好的保存。

3．熒光定量PCR豬源檢測(cè)結(jié)果

陽(yáng)性對(duì)照為豬源DNA基因檢測(cè)試劑盒（simgen，Cat.No.7804050）中的強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為100 ng/μl，對(duì)比熒光曲線和Ct值，我們提取的軟骨DNA豬源陽(yáng)性很強(qiáng)，Ct值相差很小，說(shuō)明此軟骨確實(shí)是豬來(lái)源。

通過(guò)這個(gè)實(shí)驗(yàn)，我們可以得出以下結(jié)論：

1. 軟骨中的DNA含量比較高，可以作為鑒定樣本提取DNA。

2. Simgen 動(dòng)物組織DNA試劑盒能高效地提取到軟骨中的基因組DNA。

3. 干燥的軟骨中提取到的DNA的完整度很高，所以推測(cè)從風(fēng)干的人或動(dòng)物尸體中的軟骨組織中取樣提取DNA也是不錯(cuò)的選擇。

Simgen實(shí)驗(yàn)室