在痕量級(jí)（pg至ng級(jí)別）核酸的分離、純化過(guò)程中，不論是經(jīng)典的酚氯仿抽提+醇沉淀，或者是現(xiàn)在市場(chǎng)上主流的硅膠膜法或磁珠法，回收率都會(huì)嚴(yán)重降低，最多的能損失90%的核酸。如果在痕量核酸提取體系中額外添加Carrier RNA，其結(jié)果就是將痕量級(jí)的核酸分離純化體系重新還原到μg級(jí)別核酸的分離純化體系。如果用熒光定量PCR檢測(cè)回收的痕量核酸，其結(jié)果就是添加Carrier RNA的檢測(cè)結(jié)果會(huì)明顯減小3~4個(gè)CT值。病毒核酸回收體系是業(yè)界公認(rèn)的痕量級(jí)核酸回收體系，一家核酸診斷試劑公司提供的病毒核酸提取體系是否有添加Carrier RNA，幾乎可以直接推斷出該企業(yè)提供的病毒核酸檢測(cè)產(chǎn)品的靈敏度。因此2020年的新冠病毒疫情導(dǎo)致Simgen的Carrier RNA一躍成為了公司的明星產(chǎn)品。由于很多用戶向我們?cè)儐?wèn)“Carrier RNA室溫能放多久”、“寄到的時(shí)候冰袋不冷了，Carrier RNA還能用嗎”等諸多問(wèn)題，所以我們特地耗時(shí)2個(gè)月專門對(duì)Carrier RNA進(jìn)行了真實(shí)穩(wěn)定性測(cè)試。

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/span>

測(cè)試Carrier RNA的穩(wěn)定性：37℃環(huán)境下存放的液體Carrier RNA對(duì)使用性能的影響。

二、實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備：

Carrier RNA（Simgen Cat.No.4003101）

RNA保護(hù)劑（Simgen Cat.No.4006030）

DL 2000 Marker (Simgen Cat.No.MD1006 )

電熱恒溫培養(yǎng)箱（上虞市滬越儀器設(shè)備廠，DHG 303-0）

電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-6C型 ）

病毒核酸提取試劑盒（Simgen Cat.No.4002050）

臺(tái)式離心機(jī)（eppendorf Centrifuge 5415 D）

2×One Step Probe RT-PCR Mix（Simgen Cat.No.7406100）

熒光定量PCR儀（ABI 7500）

新冠病毒引物及探針（F:CCCTGTGGGTTTTACACTTAA/R:ACGATTGTGCATCAGCTGA,

Probe:5′FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1′3）

新冠假病毒（用血清稀釋到10⁶ copies/ml）

三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：

1. 取兩支同一批次的Carrier RNA（1 ml），一支放置于﹣20℃冰箱保存，一支放置于37℃恒溫箱保存。

2. 每天取出兩支Carrier RNA，各吸取10 μl用RNA保護(hù)劑稀釋60倍，混勻。

3. 各取5 μl加入1%的瓊脂糖凝膠中，加入5 μl DL 2000 Marker，電泳20 min，觀察條帶情況。

4. 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行一段時(shí)間后，分別用添加了這兩支Carrier RNA的Simgen病毒核酸提取試劑盒提取血清中的新冠假病毒，并使用2×One Step Probe RT-PCR Mix進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)試。

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1. 電泳結(jié)果：（由于圖片較多，且很多圖片中的Carrier RNA條帶情況相差不大，因此選擇了其中變化較明顯的圖片）

正式實(shí)驗(yàn)前先進(jìn)行了一次電泳測(cè)試，因?yàn)槭峭慌蔚?，此時(shí)的兩支Carrier RNA電泳條帶幾乎一樣，沒有差別。

實(shí)驗(yàn)第3天，兩支Carrier RNA的條帶沒有明顯差別。

實(shí)驗(yàn)第7天，可以看到兩支Carrier RNA的條帶開始出現(xiàn)差別，37℃保存的Carrier RNA條帶出現(xiàn)不太明顯的降解情況。

實(shí)驗(yàn)第12天，可以看到37℃保存的Carrier RNA降解情況已經(jīng)較為明顯，拖尾情況比前幾天要嚴(yán)重一些。

實(shí)驗(yàn)第19天，可以看到37℃保存的Carrier RNA降解情況較為嚴(yán)重了，較長(zhǎng)的條帶已經(jīng)暗淡了很多。

實(shí)驗(yàn)第27天，可以看到37℃保存的Carrier RNA較長(zhǎng)的條帶只能隱約看到了，降解非常嚴(yán)重。實(shí)驗(yàn)第19天，可以看到37℃保存的Carrier RNA降解情況較為嚴(yán)重了，較長(zhǎng)的條帶已經(jīng)暗淡了很多。

 實(shí)驗(yàn)第33天，可以看到37℃保存的Carrier RNA較長(zhǎng)的條帶幾乎看不見了，但是兩條帶之間的區(qū)域還是有拖尾。

實(shí)驗(yàn)第46天，可以看到37℃保存的Carrier RNA兩條帶之間的拖尾也已經(jīng)降解得快看不到了。

實(shí)驗(yàn)第59天（最后一次實(shí)驗(yàn)，因?yàn)闇y(cè)試用的Carrier RNA使用完了），可以看到此時(shí)37℃保存的Carrier RNA狀態(tài)和之前第46天時(shí)差不多，這十多天變化并不是很明顯，降解的Carrier RNA片段主要集中在500 nt~1000 nt的位置。實(shí)驗(yàn)第46天，可以看到37℃保存的Carrier RNA兩條帶之間的拖尾也已經(jīng)降解得快看不到了。

2. 熒光定量PCR結(jié)果：（實(shí)驗(yàn)第46天（圖9）時(shí)進(jìn)行的測(cè)試）

3、4是使用﹣20℃保存的Carrier RNA提取的新冠假病毒RNA的RT-qPCR結(jié)果；1、2是使用37℃保存的Carrier RNA提取的新冠假病毒RNA的RT-qPCR結(jié)果；

5、6是未使用Carrier RNA提取的新冠假病毒RNA的RT-qPCR結(jié)果。 

五、實(shí)驗(yàn)討論與分析：

1. 結(jié)合圖1~圖10分析可知，由于Carrier RNA是溶解在RNA保護(hù)劑中的，所以液體Carrier RNA在37℃條件下存放了接近2周時(shí)間才開始觀察到較明顯的降解現(xiàn)象。如果Carrier RNA放在室溫環(huán)境下（15-25℃），估計(jì)要2周以上才能觀察到較為明顯的降解現(xiàn)象。當(dāng)然也說(shuō)明了液體Carrier RNA如果要長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定保存，還是需要放在﹣20℃。

2. 結(jié)合圖2~圖5可知，液體Carrier RNA在37℃下短期內(nèi)放置影響不大，至少7天之內(nèi)Carrier RNA的電泳帶型未發(fā)生明顯的變化。因此即便是用戶收到Carrier RNA時(shí)發(fā)現(xiàn)冰袋已經(jīng)融化，只要時(shí)間不超過(guò)7天（除非環(huán)境溫度高達(dá)40~50℃），也并不需要擔(dān)心產(chǎn)品的使用性能會(huì)受到影響。

3. 結(jié)合圖11可以發(fā)現(xiàn)37℃保存過(guò)、有降解的Carrier RNA提取的假病毒RNA的RT-qPCR的CT值居然比﹣20℃保存的還要小一些。出現(xiàn)這樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)在令人費(fèi)解，但是我們實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果仍然是有降解的Carrier RNA用于假病毒RNA提取后RT-qPCR的CT值小于﹣20℃保存的Carrier RNA。所以我們得出的結(jié)論是37℃放置了一個(gè)多月（46天），電泳觀測(cè)有降解的Carrier RNA對(duì)使用性能仍然沒有影響。

4. 結(jié)合圖9和10的對(duì)比，可以觀察到37℃下保存46天和59天的Carrier RNA電泳帶型差別不大，因此我們估計(jì)即便是37℃下保存了2個(gè)月的Carrier RNA，對(duì)使用性能也還是沒有影響。

由于在病毒RNA純化體系中，如果加入過(guò)多的Carrier RNA，對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶會(huì)產(chǎn)生干擾這一點(diǎn)我們是已知的。因此我們猜測(cè)，在相同濃度的前提下，可能是降解的Carrier RNA（本質(zhì)上是片段500 nt~1000 nt范圍內(nèi)的Carrier RNA）比完整的Carrier RNA對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶的干擾更少，所以在RT-qPCR的結(jié)果上顯示出來(lái)的就是CT值稍微小一些。當(dāng)然真正的原因，仍然是未知，我們歡迎閱讀的同學(xué)、老師們提出你們的猜想。