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眾所周知，RNA非常脆弱，因?yàn)榄h(huán)境中到處都有它的天敵——RNA酶，一不小心RNA就被降解了。而RNase Inhibitor的出現(xiàn)很好地解決了這一問(wèn)題，它能與RNA酶結(jié)合，抑制RNA酶的活性，從而保護(hù)RNA，因此在很多RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，添加RNase Inhibitor是必須的，那么如何判斷RNase Inhibitor的性能效果呢？今天我們就給大家介紹兩種RNase Inhibitor性能檢測(cè)方法。
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/span>
用不同方法對(duì)RNase Inhibitor性能效果進(jìn)行檢測(cè)。
二、實(shí)驗(yàn)材料：
1. 檢測(cè)RNase Inhibitor（兩種方法檢測(cè)的不是同一批次）和對(duì)照RNase Inhibitor（40 U/μl）
2. RNase A：50 mg/ml（Simgen Cat.No.8001001）
3. RNA樣本：大鼠肌肉組織RNA、Carrier RNA
4. Rat β-acting引物（Forward：CCCATCTATGAGGGTTACGC/Reverse：TTTAATGTCACGCACGATTTC）
5. cDNA第一鏈合成試劑盒（Simgen Cat.No.7306025）、2×SYBR Green PCR Mix（Simgen Cat.No.7106100）
6. 熒光PCR儀（ABI 7000）
7. PCR儀（Techne FPROGO5Y Progene Thermal）
8. 臺(tái)式離心機(jī)（eppendorf Centrifuge 5415 D）
9. 電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-6C型 ）
三、實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果：
方法一：熒光PCR法
1. 將RNase A梯度稀釋至5 ng/μl；
2. 將cDNA第一鏈合成試劑盒中的試劑、大鼠RNA（317 ng/μl）、2×SYBR Green PCR Mix、引物在室溫（15-25℃）解凍，解凍后迅速置于冰上。使用前將每種溶液混勻，簡(jiǎn)短離心。
3. 按照表1的基因組DNA去除體系配制混合液，徹底混勻。簡(jiǎn)短離心，并置于37℃，孵育30 min，以保證RNase A有充分時(shí)間去降解RNA。然后置于42℃，孵育3 min，置于冰上放置。
編號(hào) 試劑 | 陰性對(duì)照 | 對(duì)照組 | 檢測(cè)組 | 空白對(duì)照 | ||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | |
5×gDNA Buffer（μl） | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
RNA（μl） | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
RNase A（ng） | 1.6 | 1.6 | 1.6 | 1.6 | 1.6 | 1.6 | -- | -- |
RNase Inhibitor（μl） | -- | -- | 1 | 1 | 1 | 1 | -- | -- |
RNA-Free H2O（μl） | 補(bǔ)足到10μl | |||||||
注：為避免RNA與RNase A接觸提前發(fā)生降解，預(yù)先將RNase Inhibitor與RNase A按比例混合后再加入體系。
4、按照表2的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系配制混合液。
5× RT Buffer | 4μl |
RT Enzyme Mix | 2μl |
RT Primer Mix | 4μl |
表2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系
5、將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中的混合液，加到gDNA去除反應(yīng)體系的混合液中，充分混勻，簡(jiǎn)短離心以收集殘留在管壁的液體。
6、42℃，孵育15 min。
7、95℃，孵育3 min之后放于冰上。
8、用2×SYBR Green PCR Mix、Rat β-acting引物配置反應(yīng)液，取5 μl cDNA進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)。
根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果可知，陰性對(duì)照組（1、2）CT值為25.78和25.04，平均值為25.41，對(duì)照組（3、4）CT值為20.03和19.84，平均值為19.935，檢測(cè)組（5、6）CT值為21.70和21.34，平均值為21.52，空白對(duì)照組（7、8）CT值為19.28和19.56，平均值為19.42。由此得出結(jié)論，陰性對(duì)照組CT值比空白對(duì)照組CT值大，說(shuō)明其中的RNA有部分被RNase A降解了；而檢測(cè)組CT值比陰性對(duì)照組CT值小，比對(duì)照組CT值大，說(shuō)明檢測(cè)組的RNase Inhibitor確實(shí)起到了抑制RNase A的作用，但效果沒(méi)有對(duì)照組好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
方法二：電泳法
1. 將RNase A（50 mg/ml）稀釋至10 ng/ul、1 ng/ul、0.1 ng/ul、0.01 ng/ul，按下表配置反應(yīng)體系，兩組檢測(cè)組（檢測(cè)RNase Inhibitor和對(duì)照RNase Inhibitor），一組陰性對(duì)照（不加RNase Inhibitor）以及一組空白對(duì)照組，平行做兩管。
檢測(cè)組 | Rnase A （10 ng/ul） | Rnase A （1 ng/ul） | Rnase A （0.1 ng/ul） | Rnase A （0.01 ng/ul） |
5xRT Buffer | 4μl | 4μl | 4μl | 4μl |
RNase Inhibitor | 1μl | 1μl | 1μl | 1μl |
Rnase A | 2μl | 2μl | 2μl | 2μl |
RNA（500 ng/μl） | 1μl | 1μl | 1μl | 1μl |
RNase-free Water | 12μl | 12μl | 12μl | 12μl |
陰性對(duì)照 | Rnase A （10 ng/ul） | Rnase A （1 ng/ul） | Rnase A （0.1 ng/ul） | Rnase A （0.01 ng/ul） |
5xRT Buffer | 4μl | 4μl | 4μl | 4μl |
RNase Inhibitor | - | - | - | - |
Rnase A | 2μl | 2μl | 2μl | 2μl |
RNA（500 ng/μl） | 1μl | 1μl | 1μl | 1μl |
RNase-free Water | 13μl | 13μl | 13μl | 13μl |
空白對(duì)照組 |
|
RNA（500 ng/μl） | 1μl |
RNase-free Water | 19μl |
3. 取5 ul混液+1 ul 6×Loading Buffer，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。
四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
從電泳結(jié)果分析，加了RNA酶的樣本，隨著RNase A濃度的減少，降解更慢，從降解情況看，對(duì)照組RNase Inhibitor和檢測(cè)組RNase Inhibitor效果差不多。
五、討論與分析：
1. 兩種方法都可以對(duì)RNase Inhibitor的效果性能進(jìn)行一種有效的檢測(cè)。熒光法比較直觀，可以準(zhǔn)確的通過(guò)CT值大小得出結(jié)論；電泳法相對(duì)而言實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有熒光PCR法準(zhǔn)確，只能簡(jiǎn)單通過(guò)肉眼判斷差異，但是勝在操作更加簡(jiǎn)單、方便快捷。
2. 如果想要精確判斷檢測(cè)的RNase Inhibitor具體活力濃度，推薦使用熒光PCR法；如果只想粗略判斷RNase Inhibitor效果，則可以使用電泳法。
本試劑盒含有全新高效的gDNase，3min高效去除gDNA，讓基因組DNA在反轉(zhuǎn)前高效去除；高效Quant逆轉(zhuǎn)錄酶，僅需15 min即可合成滿足熒光定量實(shí)驗(yàn)的第一鏈cDNA，反轉(zhuǎn)效率可高達(dá)90%。 查看產(chǎn)品
RNase Inhibitor RNase是以可溶形式在大腸桿菌中表達(dá)純化的重組RNase抑制劑，與存在于人胎盤(pán)中的特異性核糖核酸酶抑制劑具有相同的應(yīng)用效果，其本質(zhì)是分子量為51,000 Da的蛋白質(zhì)，等電點(diǎn)pH值為4.7。 查看產(chǎn)品