前段時間，小編做感受態(tài)細胞檢測總是效果不佳，不得已逐一排查影響因素。原來只是想看看質(zhì)粒DNA是不是有降解的現(xiàn)象，結(jié)果出乎意料地發(fā)現(xiàn)了一個驚人的結(jié)果：質(zhì)粒DNA不但沒降解，反過來似乎連在一起，分子量變大了？！

先描述下實驗測試的方法：

一、實驗準(zhǔn)備：

質(zhì)粒樣本：新鮮抽提的pUC-19以及-20℃冰箱里存放并且多次使用的pUC-19。

實驗材料：1%的瓊脂糖凝膠、1.5ml離心管、EcoR I內(nèi)切酶。

實驗設(shè)備：臺式小量離心機、電泳儀、恒溫培養(yǎng)箱、微量紫外分光光度計、移液器等。

二、實驗內(nèi)容：

1、取20μl新鮮提取的pUC-19以及冰箱存放的pUC-19，分別配制EcoR I酶切體系置于37℃培養(yǎng)箱中酶切2h；

2、在1%的瓊脂糖凝膠上，依次加入質(zhì)粒DNA或相應(yīng)質(zhì)粒DNA的酶切產(chǎn)物，分別在電泳進行15min、30min、45min后在紫外燈下觀察結(jié)果并拍照。

三、實驗結(jié)果：

為了更清晰地描述，小編特意做了一張模擬圖，如下，

 可能很多人都聽說經(jīng)典的質(zhì)粒DNA三條帶的理論：“共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）： 質(zhì)粒的兩條鏈沒有斷裂，超螺旋結(jié)構(gòu)；開環(huán)DNA（ocDNA）： 質(zhì)粒的一條鏈斷裂，松弛的環(huán)狀分子；線形DNA（lDNA）： 質(zhì)粒的兩條鏈均斷裂，線性分子”。

 按照上述理論，C是超螺旋結(jié)構(gòu)；A是一條鏈斷裂，松弛的環(huán)狀分子； B是線性分子（B在單酶切的位置）。但是松弛的環(huán)狀質(zhì)粒DNA為什么比線性質(zhì)粒DNA跑得慢呢？既然超螺旋結(jié)構(gòu)因為穿過瓊脂糖凝膠的阻力最小，跑得最快，那A（松弛的環(huán)狀分子）應(yīng)該跑第二位啊？

再有：位置A一開始總是與B重合的，以至于我們平時總是下意識地將它認(rèn)作是線性質(zhì)粒。然而，當(dāng)電泳時間足夠長時，它會與B位置分隔開，并且在新鮮提取的質(zhì)粒（含量較少）、存放過久的質(zhì)粒及其酶切產(chǎn)物中都會出現(xiàn)。而且在冰箱凍存過的質(zhì)粒體系中占有很大的比重（電泳條帶寬度及亮度）。這A到底什么鬼？

請教領(lǐng)導(dǎo)，結(jié)果領(lǐng)導(dǎo)反對經(jīng)典的三條帶理論，明確地表示：C位置為我們常見的超螺旋結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒，B位置為pUC19酶切后的線性質(zhì)粒，A是兩個超螺旋結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒DNA聚合在一起了，簡稱質(zhì)粒二聚體。質(zhì)粒二聚體理論上是正在復(fù)制的過程中的質(zhì)粒被提取出來了，所以分子量是超螺旋結(jié)構(gòu)的一倍。

聽上去還是領(lǐng)導(dǎo)的理論更合理，那問題來了：為什么質(zhì)粒在冰箱里凍存一段時間后超螺旋結(jié)構(gòu)大量地轉(zhuǎn)變成了二聚體結(jié)構(gòu)呢？。結(jié)果領(lǐng)導(dǎo)兩手一攤，不知道。最后他說，實際上A是二聚體也只是看上去更合理的一種理論而已，不排除其他的可能性。你可去大膽地去猜測形成二聚體質(zhì)粒（或者是松弛環(huán)狀分子）的各種原因，重要的是用實驗去驗證你的理論。

于是小編開始了天馬行空的臆想：

1. 第一個嫌疑是反復(fù)凍融--在分子生物學(xué)實驗中，經(jīng)常會看到一句話“切忌反復(fù)凍融”，會不會是因為凍融過程中形成的冰晶對質(zhì)粒DNA產(chǎn)生了損傷，才導(dǎo)致質(zhì)粒DNA電泳的帶型產(chǎn)生變化的？如果質(zhì)粒DNA損傷的理論是正確的，似乎A是松弛環(huán)狀分子更合理，唯一的矛盾是A酶切不能被完全切開，很難解釋。

2. 如果是反復(fù)凍融先損傷質(zhì)粒DNA--比如產(chǎn)生了部分單鏈DNA，再由于質(zhì)粒之間有大量共同序列，或許部分單鏈DNA之間就互補配對上了，結(jié)果就生成了A(質(zhì)粒二聚體)。這樣似乎也解釋了為什么有一部分A（質(zhì)粒二聚體）酶切切不開：如果酶切位點剛好包含在二聚體的鉸鏈中（包括在酶切位點附近），估計限制性內(nèi)切酶就無能為力了。

3. 除了反復(fù)凍融，還有什么因素會損傷DNA呢？染菌!質(zhì)粒DNA并不是在無菌環(huán)境下提取的，有微生物在質(zhì)粒DNA中就難說了，會不會是微生物產(chǎn)生的酶類促使質(zhì)粒部分解旋成單鏈并與其它質(zhì)粒纏繞在一起從而形成二聚體呢？——至少這個猜測比較容易設(shè)計實驗驗證。

4. 或許是DNA溶液中殘留的二價陽離子是罪魁禍?zhǔn)?/span>……DNA分子不是帶負(fù)電的嗎，二價陽離子左手右手各拉一個質(zhì)粒DNA，二聚體就產(chǎn)生了……

當(dāng)然，以上影響因素都是小編的主觀猜測，并不能確定是誰是導(dǎo)致質(zhì)粒結(jié)構(gòu)變化的罪魁禍?zhǔn)?，如果您也有類似的發(fā)現(xiàn)，并且還用實驗測試驗證過，歡迎告知我們：technical@simgen.cn

回到轉(zhuǎn)化實驗，既然質(zhì)粒DNA在電泳能呈現(xiàn)那么多不同的帶型，那么不同帶型的質(zhì)粒對轉(zhuǎn)化效率有什么影響呢？請繼續(xù)關(guān)注我們下一期的核酸技術(shù)探索。