1. 紅細胞裂解液的稀釋：根據(jù)處理血液樣品的體積選取適當(dāng)體積的10×紅細胞裂解液（例如待處理的血液樣品體積為200 μl，則取140 μl 10×紅細胞裂解液），用RNase-free ddH2O 稀釋至1×紅細胞裂解液。 

2. 向1 體積人類全血中加5 倍體積1×紅細胞裂解液(需自備合適的干凈管子)。 注意：為獲得最佳的混勻效果，血液和1×紅細胞裂解液的混合液體積不應(yīng)超過管子體積的3/4。如果血液中的白細胞含量較高，可按比例減小血液的使用體積，第6 步中的裂解液RL的使用體積也要進行相應(yīng)調(diào)整。 

3. 在冰上孵育10-15 分鐘，在孵育過程中渦旋振蕩混勻2 次。 

注意：在孵育的過程中溶液將變成半透明狀態(tài)，表明紅細胞裂解。如果必要的話， 孵育時間可延長至20 分鐘。 

4. 4℃ 2,100rpm (~400×g)離心10 分鐘，將上清完全去除。 

注意：離心后白細胞可能會形成小球，確保完全去除上清，痕量紅細胞的存在， 會使白細胞小球呈現(xiàn)紅色，而該現(xiàn)象會在隨后的漂洗步驟中消失。 

5. 向白細胞沉淀中加入1×紅細胞裂解液（加入1×紅細胞裂解液的體積是第1 步中全血用量的2 倍），重懸細胞。 

6. 4℃，2,100rpm (~400×g)離心10 分鐘，將上清完全去除。 

注意：如果上清去除不完全將會影響裂解及隨后的RNA 與膜的結(jié)合，導(dǎo)致最后 RNA產(chǎn)率降低。 

7. 向白細胞沉淀中加入裂解液RL（使用前請加入β-巰基乙醇），具體加量按照下表進行，渦旋或使用移液器混勻。 

注：如果血液不是健康人的全血，需要根據(jù)血液中白細胞的數(shù)量來確定所需裂解 液RL的體積，此時細胞應(yīng)完全裂解，塊狀細胞沉淀消失。 

8. 將溶液轉(zhuǎn)移至過濾柱CS 中（過濾柱CS 放在收集管中），12,000 rpm (~13,400×g )離心2 分鐘，棄去過濾柱CS，收集濾液。 

注意：為避免氣溶膠的形成，請將移液器調(diào)整到≥750μl以保證一次性將所有溶液轉(zhuǎn)移到過濾柱上，如果細胞太多，將會出現(xiàn)裂解液粘稠的現(xiàn)象，造成難以吸取的情況。 

9. 向濾液中加入1 倍體積70%乙醇（通常為350μl 或600μl），混勻（此時可能會出現(xiàn)沉淀），得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱CR2 中（吸附柱CR2 放入收集管中），12,000 rpm(~13,400×g )離心30-60 秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR2 放回收集管中。 

注意：配制70%乙醇時請使用RNase-free ddH2O，如果濾液體積有所損失，請 相應(yīng)減少70%乙醇用量。將溶液和沉淀轉(zhuǎn)移至吸附柱CR2 時，體積大于吸附柱 容量，可以分兩次完成。 

10. 向吸附柱CR2 中加入350 μl 去蛋白液RW1，12,000 rpm(~13,400×g)離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR2 放回收集管中。 

11. DNase I 工作液的配制：取10 μl DNase I 儲存液放入新的RNase-free 離心管

中，加入70 μl RDD 溶液，輕柔混勻。 

12. 向吸附柱CR2 中央加入80 μl 的DNase I 工作液，室溫放置15 分鐘。

 13. 向吸附柱CR2 中加入350 μl 去蛋白液RW1，12,000 rpm(~13,400×g)離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR2 放回收集管中。 

14. 向吸附柱CR2 中加入500 μl漂洗液RW （使用前請先檢查是否已加入乙醇），室溫靜置2 分鐘，12,000 rpm(~13,400×g)離心30-60 秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR2 放回收集管中。 

15. 重復(fù)步驟14。 

16. 12,000 rpm(~13,400×g)離心2 分鐘，倒掉廢液。將吸附柱CR2 置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。 

注意：此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，離心后將吸附柱CR2 在室 溫放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液殘留，可能會影響后續(xù)的RT等實驗。 

17. 將吸附柱CR2 轉(zhuǎn)入一個新的RNase-free 離心管中，加入30-50 μl RNase-free ddH2O 室溫放置2 分鐘，12,000 rpm(~13,400×g)離心2 分鐘，得到RNA 溶液。 注意：洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于30 μl，體積過小影響回收效率。RNA溶液請于 -70℃保存。