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食品物種源性檢測之一——牛肉制品的動物源性檢測

作者:新景實驗室
版權(quán)說明:本文系原創(chuàng)文章 轉(zhuǎn)載請標(biāo)注出處和本文鏈接

肉制食品摻假的情況主要是以低價肉替代高價肉,從而達到降低成本賺取差價的目的。因此雞、鴨等肉制品的摻假情況較少,而牛、羊、驢等肉制品的摻假現(xiàn)象較多,特別是驢肉和羊肉摻假情況尤為嚴重。實驗室最近購買了幾種肉制品,準(zhǔn)備檢測其中的摻假情況,接下來就讓小新帶大家看看情況到底怎么樣吧。

 

一、 實驗?zāi)康?/span>

對牛肉制品進行動物源性檢測,判斷其所含成分。

 

二、 實驗材料

1. 肥牛卷杭州達泰食品有限公司)、動物組織DNA試劑盒(Simgen Cat.No.3101050)牛源性DNA熒光PCR檢測試劑盒(Simgen Cat.No.7801050),雞源性DNA熒光PCR檢測試劑盒(Simgen Cat.No.7805050),豬源性DNA熒光PCR檢測試劑盒(Simgen Cat.No.7804050)鴨源性DNA熒光PCR檢測試劑盒(Simgen Cat.No.7806050),1.5 ml離心管若干,一次性手術(shù)刀

2. 臺式小量離心機eppendorf Centrifuge 5415D

旋渦振蕩器(杭州米歐儀器有限公司XH-C)

電子恒溫不銹鋼水浴鍋(上海宜昌儀器紗篩廠)

超微量分光光度計(Simgen Cat.No.Sim-100

超微量電子天平(福州華科電子儀器有限公司 TP-213

電泳儀(北京六一儀器廠 DYY-6C型)

ABI PRISM®7500熒光PCR

三、 實驗方法

(一)DNA提取方法

1. 用手術(shù)刀切取25 mg肥牛卷,再用刀尖將組織剁成勻漿狀,轉(zhuǎn)移組織到一個1.5 ml離心管中。

2. 加入20 μl蛋白酶K貯存液,再加入180 μl 56 ℃預(yù)熱的Buffer AT,旋渦振蕩數(shù)秒使組織勻漿分散開來。

3. 56℃水浴30分鐘,期間旋渦振蕩數(shù)次幫助組織溶解。

4. 加入200 μl Buffer SL,旋渦振蕩約15秒混勻。將離心管置于70 ℃水浴10分鐘。

5. 加入200 μl無水乙醇,旋渦振蕩約15秒混合均勻。

6. 吸取步驟5中的溶液加入到核酸純化柱(純化柱置于2 ml離心管中)中,蓋上管蓋,12000 rpm離心30秒。

7. 2 ml離心管中的濾液,將核酸純化柱置回到2 ml離心管中,在核酸純化柱中加入500 μl Buffer WA(加入無水乙醇), 蓋上管蓋,12000 rpm離心30秒。

8. 2 ml離心管中的濾液,將核酸純化柱置回到2 ml離心管中,在核酸純化柱中加入600 μl Buffer WB(加入無水乙醇), 蓋上管蓋,12000 rpm離心30秒。

9. 2 ml離心管中的濾液,將核酸純化柱置回到2 ml離心管中,13200 rpm離心2分鐘。

10. 2 ml離心管,將核酸純化柱置于一個潔凈的1.5 ml離心管中,在純化柱中加入100 μl 56 ℃溫育的Buffer TE,蓋上管蓋,室溫靜置1分鐘,12000 rpm離心30秒得到DNA。

 (二)熒光PCR操作方法

1. 按照下表配置熒光PCR反應(yīng)體系:

simgen-動物組織DNA試劑盒-雞源性DNA熒光PCR檢測試劑盒-鴨源性DNA熒光PCR檢測試劑盒-豬源性DNA熒光PCR檢測試劑盒-Sim-100超微量分光光度計-熒光PCR反應(yīng)體系

5管的用量配置好PCR反應(yīng)混合液,按每管35 μl的量將反應(yīng)混合液分裝到八聯(lián)管中。

2. 10 μl提取的DNA,加入90 μl ddH2O混合均勻,將其稀釋10倍作為DNA模板。

3. 依次在PCR反應(yīng)混合液中平行加入4.2 μlDNA模板、ddH2O(陰性對照)、陽性對照(牛DNA、豬DNA、雞DNA、鴨DNA),蓋上管蓋,簡短離心,最后于ABI PRISM®7500熒光PCR儀中進行熒光定量PCR。實驗參數(shù)如下:(95℃ 1 min;95℃ 10s60℃ 30s×40 cycles

四、 實驗結(jié)果

微量分光光度計上用Buffer TE調(diào)零,測量洗脫下來的DNA,結(jié)果如下:
simgen-動物組織DNA試劑盒-雞源性DNA熒光PCR檢測試劑盒-鴨源性DNA熒光PCR檢測試劑盒-豬源性DNA熒光PCR檢測試劑盒-Sim-100超微量分光光度計-洗脫下來的DNA測量結(jié)果


2.1%的瓊脂糖凝膠上,加入5 μl提取到的DNA,電泳20分鐘,結(jié)果如下:
simgen-動物組織DNA試劑盒-雞源性DNA熒光PCR檢測試劑盒-鴨源性DNA熒光PCR檢測試劑盒-豬源性DNA熒光PCR檢測試劑盒-Sim-100超微量分光光度計-電泳圖

3.熒光PCR擴增結(jié)果如下:
simgen-動物組織DNA試劑盒-雞源性DNA熒光PCR檢測試劑盒-鴨源性DNA熒光PCR檢測試劑盒-豬源性DNA熒光PCR檢測試劑盒-Sim-100超微量分光光度計-熒光PCR擴增結(jié)果
simgen-動物組織DNA試劑盒-雞源性DNA熒光PCR檢測試劑盒-鴨源性DNA熒光PCR檢測試劑盒-豬源性DNA熒光PCR檢測試劑盒-Sim-100超微量分光光度計-物種源性試劑盒熒光PCR 的CT值圖

五、 討論與分析

1. 超微量分光光度計測量結(jié)果可知,從肥牛卷中成功提取到了一定量的DNA,其中A260/280比值偏高,考慮到肥牛卷是加工產(chǎn)品,RNA還存在的可能性極低,推測是降解的DNA。結(jié)合電泳圖可知,提取的DNA確實存在嚴重的拖尾情況,不過主條帶清晰明顯,不影響后續(xù)的PCR擴增。

2. 由熒光PCR檢測結(jié)果可知,此款肥牛卷中除了檢測到源性成分外,還檢測到了源性成分、雞源性成分和源性成分。但是源性成分、雞源性成分和源性成分CT值分別為:32.91532.997、34.823,35.013、34.923,34.891,相比牛源性成分檢測到的數(shù)字要大13-14CT值,推算下來濃度差距達到將近一萬倍,摻假從動機上分析可能性不成立。

3. 由于CT值接近35被稱為臨界陽性值(即只有幾個DNA分子檢測到的CT值),所以我們推測這些非牛源的DNA來源最大的可能性是肉類加工過程中的檢疫、運輸、包裝等流程所摻入的,杭州達泰食品有限公司提供的肥牛卷沒有摻假行為。











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