近些年來，隨著基因檢測和健康體檢的普及，唾液樣本由于其無痛采集、采樣方便的優(yōu)點(diǎn)變成了一種非常好的DNA來源樣本。一般采集唾液前，為了盡可能提高DNA的得率，會(huì)要求采樣者半小時(shí)內(nèi)不進(jìn)食或飲水。那么唾液中到底有多少DNA呢，怎樣才能提高唾液DNA的得率呢？抱著這樣的疑惑，我們進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

探究唾液中的DNA濃度范圍以及如何提高唾液DNA的回收量。

實(shí)驗(yàn)材料

1. 唾液樣本；

2. 唾液DNA純化試劑盒（Simgen Cat.No.3501050）；

3. 旋渦振蕩器（越新儀器，XH-C）

4. 臺(tái)式離心機(jī)（eppendorf Centrifuge 5415 D）

5. 超微量分光光度計(jì)（Simgen Cat.No.sim100）

6. 電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-6C型 ）

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

本次實(shí)驗(yàn)測試了5位實(shí)驗(yàn)者在不進(jìn)食或飲水2小時(shí)后的唾液DNA濃度以及1位實(shí)驗(yàn)者不進(jìn)食或飲水不同時(shí)間后的唾液DNA濃度（為防止連續(xù)采集唾液對(duì)DNA濃度會(huì)有影響，改為每天采集一次）。

1. 用潔凈的一次性水杯收集1-2 ml唾液，轉(zhuǎn)移400 μl唾液到一個(gè)潔凈的1.5 ml離心管中，加入400 μl Buffer L5，劇烈搖晃離心管3－5次，再旋渦振蕩30秒混勻，最高速（≥12000 rpm）離心1分鐘。

2. 將離心上清液倒入核酸純化柱中，蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒，棄濾液。

3. 在核酸純化柱中加入700 μl Buffer WA，蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒，棄濾液。

4. 在核酸純化柱中加入800 μl Buffer WB，蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒，棄濾液。

5. 14000 rpm空離1分鐘，去除殘留液體。

6. 將核酸純化柱置于一個(gè)潔凈的1.5 ml離心管中，在純化柱的膜中央加入100 μl Buffer TE，蓋上管蓋，室溫靜置2分鐘，12000 rpm離心30秒，得到DNA。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1. 在超微量分光光度計(jì)上用Buffer TE調(diào)零，測量提取好的DNA，結(jié)果如下：

表一：不同人提供的唾液樣本提取的DNA濃度

A、B、C、D、E是5位實(shí)驗(yàn)者在不進(jìn)食、飲水2小時(shí)后提供的唾液樣本所提取出的唾液DNA。

表二：同一人在不同條件下提供的唾液樣本提取的DNA濃度

條件1、2、3是同一位實(shí)驗(yàn)者在不進(jìn)食、飲水不同時(shí)間后（0.5小時(shí)、1小時(shí)、1.5小時(shí)）提供的唾液樣本所提取出的唾液DNA；

4和5是同一唾液樣本，是該實(shí)驗(yàn)者在不進(jìn)食、飲水2小時(shí)后提供的唾液樣本，4和1、2、3一樣是直接進(jìn)行提取，5則是在添加Buffer L5試劑后置于37℃搖床震蕩2小時(shí)后（模擬唾液采集器采集唾液后運(yùn)輸?shù)男Ч┰?/span>提取的唾液DNA。1、2、3是同一位實(shí)驗(yàn)者在不進(jìn)食、飲水不同時(shí)間后（0.5小時(shí)、1小時(shí)、1.5小時(shí)）提供的唾液樣本所提取出的唾液DNA；

2. 在1%的瓊脂糖凝膠上，加入5 μl提取到的唾液DNA電泳15 min，結(jié)果如下：

A、B、C、D、E是5位實(shí)驗(yàn)者在不進(jìn)食、飲水2小時(shí)后提供的唾液樣本所提取出的唾液DNA的電泳結(jié)果；

1、2、3是同一位實(shí)驗(yàn)者在不進(jìn)食、飲水后的不同時(shí)間（0.5小時(shí)、1小時(shí)、1.5小時(shí)）提供的唾液樣本所提取出的唾液DNA的電泳結(jié)果；

4和5是同一唾液樣本，是該實(shí)驗(yàn)者在不進(jìn)食、飲水2小時(shí)后提供的唾液樣本所提取出的唾液DNA的電泳結(jié)果，4和1、2、3一樣是直接進(jìn)行提取，5則是在添加Buffer L5試劑后置于37℃搖床振蕩2小時(shí)后再提取的唾液DNA。

討論與分析：

1. 從表一數(shù)據(jù)分析可知，不同個(gè)體提供的唾液樣本中DNA含量差異非常大，5位實(shí)驗(yàn)者中，最低的只提取了0.9 μg DNA，而最高的則提取到了11 μg DNA，有10倍的差異。

2. 從表二1、2、3、4的數(shù)據(jù)分析可知，對(duì)于同一個(gè)體而言，唾液中DNA的含量相對(duì)比較穩(wěn)定。通過延長不進(jìn)食、飲水的時(shí)間，唾液DNA含量確實(shí)有所提高，因此可以通過選擇合適的時(shí)間段采集唾液以達(dá)到提高唾液DNA濃度的目的。

3. 從表二4、5的數(shù)據(jù)分析可知，延長唾液和Buffer L5的混合時(shí)間，可以有效提高唾液DNA的得率。原因是Buffer L5與唾液中的細(xì)胞混合時(shí)間越長，基因組DNA就釋放得越充分。因此如果使用的是唾液DNA采集器（Simgen Cat.No.3521001，含有Buffer L5）收集后郵寄的唾液樣本，DNA的回收量會(huì)比直接收集唾液樣本提取的DNA更高。

4. 最后我們總結(jié)如下：

1） 不同個(gè)體提供的唾液樣本中DNA含量差異非常大，從400 μl提取到的DNA，數(shù)量大概在1~11μg的范圍波動(dòng)。

2） 由于唾液中DNA的含量本質(zhì)上是唾液中所含的口腔上皮細(xì)胞和白細(xì)胞數(shù)量所決定的。因此我們猜測這種差異終究還是由不同個(gè)體的差異所決定：一個(gè)原因是有的人的口腔上皮細(xì)胞容易脫落，有的人卻不容易脫落，就非常類似于不同的人的頭皮屑數(shù)量的差異。其次就是口腔潰瘍或者牙齦炎等因素又會(huì)非常大地影響唾液中白細(xì)胞的數(shù)量。

3） 針對(duì)同一個(gè)個(gè)體，唾液中白細(xì)胞的數(shù)量相對(duì)來說就比較恒定了，影響的因素主要是唾液中脫落的口腔上皮細(xì)胞的數(shù)量。為了使唾液中的口腔上皮細(xì)胞含量達(dá)到最大值，可以選擇經(jīng)過一夜睡眠后早晨醒來未喝水狀態(tài)下采集唾液，當(dāng)然如果同時(shí)使用唾液DNA采集器（Simgen Cat.No.3521001）采集唾液，存放一段時(shí)間后提取DNA效果會(huì)更好。

4） 當(dāng)我們碰到了唾液中DNA含量低的樣本時(shí)，還有一個(gè)補(bǔ)救的方法，就是多提取幾管同一個(gè)樣本中的DNA，然后在操作步驟2時(shí)將各個(gè)不同管的離心上清多次濾過同一個(gè)核酸純化柱，這樣就可以讓DNA富集到同一個(gè)純化柱上，達(dá)到提高DNA濃度的目的了。