人每天分泌唾液在1.0-1.5 L左右,里面包含大量的消化酶、溶菌酶、免疫球蛋白、各種無機(jī)鹽離子以及白細(xì)胞、口腔脫落細(xì)胞、各種菌體細(xì)胞甚至是病毒，唾液樣本分析是人體健康的重要指標(biāo)之一。而唾液樣本采集作為一種對(duì)人體無傷害、無痛苦采集方法，也更容易被廣泛接受。唾液中含有豐富的DNA，在一個(gè)如此龐大且豐富的背景下檢測(cè)相對(duì)含量很低的單一細(xì)菌DNA是很難的。所以問題來了，我們要如何從大量的唾液樣本中提取出微量的細(xì)菌DNA呢？

首先我們來計(jì)算一下，我們要提取的DNA到底有多少？1 ml唾液大約含1億個(gè)細(xì)菌，看似數(shù)量龐大，然而將它們的DNA全部提出來也不足1 μg，更何況人體唾液中的細(xì)菌種類繁多，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)所述，人口腔細(xì)菌多達(dá)800多種，平均下來每種細(xì)菌DNA的含量已經(jīng)是痕量級(jí)的了，而1 ml唾液中人的DNA含量在20 μg左右，這是好幾個(gè)數(shù)量級(jí)的差距啊！

關(guān)于提取臨床樣本細(xì)菌DNA，比較保守的方法就是煮沸法，因?yàn)橹蠓蟹ㄒ还懿僮?，?jiǎn)單快速，省時(shí)省力，當(dāng)然煮沸法也存在著不可忽視的缺陷，這在我們下面的對(duì)比實(shí)驗(yàn)中會(huì)一一體現(xiàn)出來。我們本次的實(shí)驗(yàn)就是對(duì)比煮沸法和Simgen口腔拭子細(xì)菌純化試劑盒兩種方法分別從唾液中提取細(xì)菌DNA，誰更勝一籌呢？

實(shí)驗(yàn)材料及試劑：

枯草芽孢桿菌及相應(yīng)特異性引物、唾液、煮沸法試劑、口腔拭子DNA純化試劑盒（cat.no4300050.）、2×SYBR Green PCR Mix（Simgen，cat.no.7106100）

實(shí)驗(yàn)設(shè)備：

水浴鍋、高速離心機(jī)、移液器及熒光PCR儀

實(shí)驗(yàn)方法：

1、枯草芽孢桿菌挑單菌落于5 ml LB培養(yǎng)基中，37℃ 220 rpm過夜培養(yǎng)，為了模擬出唾液中微量細(xì)菌DNA的效果，我們用唾液按10倍梯度稀釋培養(yǎng)后的菌液，取10^-3、10^-4、10^-5、10^-6四個(gè)梯度作為提取樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。我們使用Simgen口腔拭子細(xì)菌DNA純化試劑盒和煮沸法各提一組梯度樣本。

2、煮沸法操作非常簡(jiǎn)單：取50 μl煮沸法試劑加50 μl樣本，100℃水浴10 min，12000 rpm離心吸取取50 μl上清。

3、Simgen口腔拭子細(xì)菌DNA純化試劑盒方法：①取180 μl樣本加入20 μl Buffer A10和20 μl蛋白酶K貯存液，56℃ 水浴10 min。②加入500 μl Buffer AC，旋渦震蕩數(shù)秒混勻，過核酸純化柱，12000 rpm離心30 s。③棄濾液，加入700 μl Buffer WBR，12000 rpm離心30 s。④14000 rpm空離1 min。⑤加入50 μl Buffer TE洗脫DNA。

4、將洗脫下來的DNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。

反應(yīng)體系：

 反應(yīng)條件：

 Stage 1：預(yù)變性        Reps：1

                 95℃   1 min

 Stage 2：PCR 反應(yīng)     Reps：40

                 95℃   5 s

                 60℃  33 s

 Stage 3：融解曲線繪制  Reps：1

                 95℃   15 s

                 60℃   20 s

                 95℃   15 s

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

從上面三張圖片我們可以看出，煮沸法和Simgen試劑盒法熒光PCR曲線相關(guān)性都很好，但是暴露了煮沸法其中一個(gè)致命的缺陷：檢測(cè)靈敏度低。如圖一所示，當(dāng)以從10^-6稀釋樣本中提取的DNA作為熒光PCR模板時(shí)，沒有檢測(cè)到陽性。而在圖二中，用Simgen試劑盒的方法，陽性很明顯。如果患者唾液內(nèi)的致病菌含量低于一定量的時(shí)候，使用煮沸法很有可能放過這個(gè)兇手。

我們?cè)賮砜匆幌轮蠓蟹ê?/span>Simgen試劑盒法在不同濃度梯度PCR曲線的對(duì)比，Simgen試劑盒法的靈敏度明顯比煮沸法高：

從四張對(duì)比圖中可以看出，每一個(gè)梯度Simgen試劑盒法都比煮沸法Ct值小3-4個(gè)。說明Simgen試劑盒法提取的模板DNA的濃度是煮沸法的10-16倍?；厮?/span>DNA提取的過程，這個(gè)差異也能找到一定的解釋：煮沸法樣本初始體積是50 μl，核酸終體積100μl，稀釋了1倍；Simgen試劑盒法樣本初始體積是180 μl，核酸終體積50 μl，濃縮了3.6倍。在提取效率100%的情況下，Simgen試劑盒法最后提取的核酸濃度應(yīng)該是煮沸法的7.2倍。算上核酸提取效率上的差異，實(shí)際實(shí)驗(yàn)中相差10-16倍也可以理解。

新景生物實(shí)驗(yàn)室