之前收到客戶反饋說(shuō)我們的DL2000 Ladder凝膠電泳條帶分不開(kāi)，小新第一時(shí)間聯(lián)想到曾經(jīng)也收到過(guò)類似的反饋，當(dāng)時(shí)研究后發(fā)現(xiàn)是由于使用的核酸染料濃度過(guò)高導(dǎo)致了條帶拖尾、分不開(kāi)，還寫(xiě)了一篇文章——《怎樣做一張漂亮的瓊脂糖凝膠電泳圖（續(xù)）》。于是小新就讓客戶減少核酸染料的用量，但結(jié)果仍是不理想。經(jīng)過(guò)和客戶的仔細(xì)溝通后了解到，客戶使用的核酸染料是Gelred，而Simgen實(shí)驗(yàn)室用的核酸染料是EB（溴化乙錠）。那是不是因?yàn)?/span>Gelred和EB在使用效果上的不同所導(dǎo)致的差異呢？于是小新進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)測(cè)試。

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

通過(guò)凝膠電泳，探究Gelred核酸染料對(duì)電泳結(jié)果的影響。

二、實(shí)驗(yàn)材料

Gelred（Biotium）

EB（溴化乙錠）（Simgen Cat.No.9026001）

DL2000 Ladder（Simgen Cat.No.MD1006）

50×TAE（Simgen Cat.No.9001500）

瓊脂糖（BIOWEST REGULAR AGAROSE G-10）

電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-6C型 ）

三、實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果

1. 按照客戶的實(shí)驗(yàn)條件：每100 ml的瓊脂糖凝膠加10 μl的Gelred制作1%凝膠進(jìn)行電泳測(cè)試，結(jié)果如圖一。圖二為對(duì)照的EB染料的凝膠電泳（每100 ml的瓊脂糖凝膠加10 μl的EB染料）。DL2000 Ladder的用量均為5 μl。

2. 將Gelred的濃度稀釋10倍（圖三）和100倍（圖四）后，按每100 ml的瓊脂糖凝膠加10 μl稀釋后的Gelred制作1%的凝膠，取5 μl DL2000 Ladder進(jìn)行電泳，結(jié)果如下。

3. 用泡染法進(jìn)行Gelred染色，方法如下：

①　制作一塊不含Gelred的1%凝膠，進(jìn)行電泳。

②　將GelRed（10000×）稀釋約3300倍到0.1 M NaCl溶液中，制成3×染色液。（例如將15 μl GelRed（10,000×）和5 ml 1 M NaCl加到45 ml純水中）。

③　將凝膠小心地放入合適的容器中。緩慢加入足量的3×染色液浸沒(méi)凝膠，室溫浸泡30分鐘進(jìn)行染色，結(jié)果如圖五。

四、分析與討論

1. 由圖一和圖二可知，核酸染料用量為10 μl/100 ml凝膠時(shí)，DL2000 Ladder在Gelred作為核酸染料的凝膠上確實(shí)跑不開(kāi)，但在EB作為染料的凝膠上帶型正常。

2. 由圖三和圖四可知，隨著Gelred的用量減少，DL2000 Ladder的條帶逐漸清晰分開(kāi)。

3. 由圖五可知，Gelred泡染法對(duì)DL2000 Ladder條帶分離沒(méi)有影響。Gelred的說(shuō)明書(shū)上也有說(shuō)明：因?yàn)?/span>Gelred的分子量比較大，可能會(huì)影響DNA的遷移效果，如果預(yù)制膠（將Gelred加入凝膠中進(jìn)行電泳的膠）的條帶彌散或分離不理想，建議減少DNA用量、減少Gelred用量或者使用泡染法染色。原文如下：

4. 經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的測(cè)試對(duì)比，我們還發(fā)現(xiàn)：用酶切產(chǎn)物制作的DNA Marker在含Gelred的瓊脂糖凝膠上電泳更容易產(chǎn)生條帶分不開(kāi)的現(xiàn)象，但是用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物制作的同一種DNA marker在含Gelred的瓊脂糖凝膠上電泳卻不受影響。

最后我們理一下思路，大致可以推斷出Gelred給我們電泳帶來(lái)困擾的原因了：據(jù)說(shuō)Gelred是用多碳鏈烴鏈接兩個(gè)乙錠基團(tuán)形成的大分子（合成大分子的目的是為了使乙錠基團(tuán)不能進(jìn)入細(xì)胞），既然一個(gè)Gelred分子中含有兩個(gè)乙錠基團(tuán)，那么這個(gè)Gelred分子中的兩個(gè)乙錠基團(tuán)分別嵌入到不同DNA分子中的概率就大大地提高了。這時(shí)候Gelred就像一個(gè)扣子，在電泳的過(guò)程中把兩條DNA分子硬生生粘連成了一條DNA分子，這就是電泳模糊不清的主要原因！而一個(gè)EB分子是不可能同時(shí)嵌入到兩個(gè)DNA分子中的，所以最多只能影響DNA的遷移速度（表現(xiàn)為DNA條帶變寬，而不是變模糊）。當(dāng)我們用泡染法進(jìn)行Gelred染色的時(shí)候，DNA已經(jīng)完成不同長(zhǎng)度片段的分離了，這時(shí)候染料再嵌入，電泳條帶自然就不會(huì)受影響了。同時(shí)，這也解釋了為什么酶切產(chǎn)物制作的DNA Marker受Gelred影響最嚴(yán)重，因?yàn)槊盖挟a(chǎn)物的粘性末端容易配對(duì)，一旦配對(duì)，兩個(gè)乙錠基團(tuán)分別嵌入到不同DNA分子中的概率又再次大大地提高了。

說(shuō)了這么多，怎么感覺(jué)Gelred帶來(lái)的麻煩這么多，用Gelred跑電泳不就是讓我們聰明的科研腦袋交智商稅么？要知道，EB到現(xiàn)在還只是可疑的致癌物質(zhì)，畢竟到目前為止還沒(méi)有任何證據(jù)證明直接接觸EB能對(duì)任何動(dòng)物有毒害性，因?yàn)殇寤义V的分子量也不小，并不能通過(guò)皮膚進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。不過(guò)既然目前Gelred作為公認(rèn)無(wú)毒的核酸染料已經(jīng)被各個(gè)實(shí)驗(yàn)室所接受，那我們還是給正在使用Gelred的同學(xué)提一些建議：

1. 如果電泳條帶（特別是有多種核酸條帶混在一起的，比如DNA Marker、酶切產(chǎn)物、總RNA之類）模糊不清的，請(qǐng)嘗試減少Gelred的用量，觀察問(wèn)題是否能夠解決。

2. 如果還不能解決，嘗試減少核酸的用量。因?yàn)楹怂嵊昧繙p少也能降低Gelred搭上兩條核酸分子的概率。

3. 1、2方案都解決不了，嘗試泡染法。

4. 干脆直接用EB制膠電泳。附帶說(shuō)一句，Gelred既然是用多碳鏈烴鏈接兩個(gè)乙錠基團(tuán)形成的，那兩個(gè)乙錠基團(tuán)也是有脫落風(fēng)險(xiǎn)的，所以使用Gelred時(shí)請(qǐng)和使用EB一樣做好防護(hù)措施。

最后告訴大家一個(gè)好消息：經(jīng)過(guò)Simgen技術(shù)人員耗時(shí)一個(gè)多月的研究和改進(jìn)后，新版的DL2000 Ladder（PCR擴(kuò)增產(chǎn)物制作）從去年1月份（批次20220129以后）開(kāi)始升級(jí)上線了，新版DL2000 Ladder在Gelred（10 μl/100 ml凝膠）凝膠電泳中完全沒(méi)有影響（圖六），歡迎大家放心購(gòu)買。