最近有客戶詢問(wèn)“提取培養(yǎng)細(xì)胞RNA用什么試劑盒合適”，新景有幾款試劑盒都可以提取培養(yǎng)細(xì)胞總RNA，到底推薦哪一款最好呢？于是小新通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)試對(duì)比了三種RNA提取試劑盒提取培養(yǎng)細(xì)胞總RNA的效果差異。

一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

通過(guò)模擬培養(yǎng)細(xì)胞RNA的分離純化，對(duì)比三種提取培養(yǎng)細(xì)胞總RNA的試劑盒的提取效率。本次測(cè)試中三種RNA提取試劑盒均未進(jìn)行DNase I柱上消化。

二、 實(shí)驗(yàn)材料

過(guò)夜培養(yǎng)的枯草桿菌、溶菌酶（Simgen Cat.No.8009100）、1.5 ml離心管（RNase-free）若干

超純總RNA提取試劑盒（Simgen Cat.No.5003050）

通用型總RNA提取試劑盒（Simgen Cat.No.5010050）

動(dòng)物組織/培養(yǎng)細(xì)胞總RNA試劑盒（Simgen Cat.No.5001050）

臺(tái)式離心機(jī)（eppendorf centrifuge 5415 D）、旋渦振蕩器（越新儀器，XH-C）、超微量分光光度計(jì)（Simgen Cat.No.sim-100）、電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-6C型）

三、 實(shí)驗(yàn)方法

按每管2 ml菌液收集過(guò)夜培養(yǎng)的枯草桿菌到1.5 ml離心管（RNase-free）中，共5管。每管加100 μl RNase-free Water懸浮細(xì)菌沉淀，然后加入100 μl RNase-free Water配制的溶菌酶溶液（16 mg/ml），混合均勻，37℃溫育15 min。用移液器將5管液體吹打混合均勻并合成一管，按每管100 μl的量分出9管。按照三種試劑盒的操作方法分別做三組平行提取：

（一）超純總RNA提取試劑盒

1. 向100 μl處理好的樣本中加入1 ml Buffer TL，勿棄吸頭，直接用吸頭吹打數(shù)次使細(xì)胞溶解。

2. 加入200 μl Buffer EX，蓋上管蓋，用力搖晃15秒，12000 rpm離心15分鐘。

3. 吸取600 μl上層水相轉(zhuǎn)移到一個(gè)潔凈的1.5 ml離心管中，加入600 μl Buffer DW，勿棄吸頭，直接用吸頭吸注兩次混勻，進(jìn)入步驟4的操作。

4. 吸取600 μl混合液轉(zhuǎn)移到核酸純化柱中，蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。

5. 棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，將1.5 ml離心管中剩余的液體全部轉(zhuǎn)移到核酸純化柱中，蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。

6. 棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，在核酸純化柱中加入500 μl Buffer WA，蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。

7. 棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，在核酸純化柱中加入600 μl Buffer WBR，蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。

8. 棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，13200 rpm離心2分鐘。

9. 棄2 ml離心管，將核酸純化柱置于一個(gè)RNase-free的1.5 ml離心管中，在純化柱中加入150 μl RNase-free Water，蓋上管蓋，室溫靜置1分鐘，12000 rpm離心30秒得到RNA。

（二）通用型總RNA提取試劑盒

1. 向100 μl處理好的樣本中加入300 μl Buffer RLA，用移液器吸打混勻，再加入300 μl Buffer RLK，旋渦振蕩混勻，室溫放置3-5分鐘。

2. 12000 rpm離心5分鐘，小心吸取上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)潔凈的1.5 ml離心管中。

3. 加入0.5倍上清體積的無(wú)水乙醇，旋渦振蕩混勻，使液體成混濁狀且有泡沫。

4. 吸取750 μl混合液轉(zhuǎn)移至核酸純化柱中（核酸純化柱置于2 ml離心管中），蓋上管蓋，12000 rpm離心1分鐘。

5. 棄濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，吸取剩余的混合液加入到核酸純化柱中，蓋上管蓋，12000 rpm離心1分鐘。

6. 棄濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，加入600 μl Buffer WBR，蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。

7. 棄濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，加入300 μl Buffer WBR，蓋上管蓋，13200 rpm離心2分鐘。

8. 棄2 ml離心管，將核酸純化柱置于一個(gè)RNase-free的 1.5 ml離心管中，在純化柱膜中央加入150 μl RNase-free Water，蓋上管蓋，室溫靜置2分鐘，12000 rpm離心1分鐘得到RNA。

（三）動(dòng)物組織/培養(yǎng)細(xì)胞總RNA試劑盒

1. 向100 μl處理好的樣本中加入600 μl已經(jīng)加入了β-巰基乙醇的Buffer RLT，旋渦振蕩直至細(xì)胞全部溶解，溶液呈透明狀。

2. 將細(xì)胞溶解物全部轉(zhuǎn)移到過(guò)濾柱中，蓋上管蓋，13000 rpm離心2分鐘。

3. 棄過(guò)濾柱，向?yàn)V液中加入600 μl 70%乙醇并用吸頭吸注6~8次混合均勻，吸取600 μl混合液加入到核酸純化柱中，蓋上管蓋，13000 rpm離心1分鐘。

4. 棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，吸取剩余的混合液加入到核酸純化柱中，13000 rpm離心1分鐘。

5. 棄2 ml離心管中的濾液，在核酸純化柱中加入500 μl Buffer WA，蓋上管蓋，13000 rpm離心1分鐘。

6. 棄2 ml離心管中的濾液，在核酸純化柱中加入600 μl Buffer WBR，蓋上管蓋，13000 rpm離心1分鐘。

7. 棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，13200 rpm離心2分鐘。

8. 棄2 ml離心管，將核酸純化柱置于一個(gè)RNase-free的1.5 ml離心管中，在純化柱的膜中央加入150 μl RNase-free Water，蓋上管蓋，室溫靜置1分鐘，12000 rpm離心30秒得到RNA。

四、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 在超微量分光光度計(jì)上用RNase-free Water調(diào)零，測(cè)量洗脫下來(lái)的RNA，結(jié)果如下：

2. 在1%的瓊脂糖凝膠上加入5 μl洗脫的RNA（每種提取試劑盒取兩管平行）進(jìn)行電泳，結(jié)果如下：

3. 三種RNA試劑盒操作時(shí)間及價(jià)格差異

五、 分析與討論

1. 對(duì)比不同試劑盒提取到的RNA濃度可知，動(dòng)物組織/培養(yǎng)細(xì)胞總RNA試劑盒提取的細(xì)菌RNA濃度最高，遠(yuǎn)高于超純總RNA提取試劑盒和通用型總RNA提取試劑盒提取的細(xì)菌RNA；通用型總RNA提取試劑盒提取的細(xì)菌RNA濃度也略高于超純總RNA提取試劑盒。

2. 通過(guò)電泳圖分析可知，動(dòng)物組織/培養(yǎng)細(xì)胞總RNA試劑盒提取的細(xì)菌RNA主條帶最亮，基因組DNA最少，RNA的小片段也最少。通用型總RNA提取試劑盒提取的細(xì)菌RNA中基因組DNA含量最多。超微量分光光度計(jì)測(cè)得的濃度和電泳的RNA亮度有對(duì)應(yīng)關(guān)系。

3. 從RNA提取的原理上分析，不同試劑盒提取的RNA濃度上有差異也是有各自的原因的：

1） 超純總RNA提取試劑盒采用的是酸性酚萃取RNA的原理，本質(zhì)上與Trizol試劑提取RNA相同。Trizol試劑在萃取RNA的過(guò)程中，在沉淀去除大部分基因組DNA的同時(shí)，RNA也會(huì)跟著丟失掉一部分，所以超純總RNA提取試劑盒提取到的RNA是最少的，當(dāng)然殘留的基因組DNA也不是最多的。

2） 通用型總RNA提取試劑盒和動(dòng)物組織/培養(yǎng)細(xì)胞總RNA試劑盒均沒(méi)有萃取步驟，為什么通用型總RNA提取試劑盒提取的RNA濃度更低一些呢？實(shí)際上真正的原因是通用型總RNA提取試劑盒在溶解細(xì)菌細(xì)胞后DNA和RNA共同吸附到了純化柱上，大片段基因組DNA與RNA的互相纏繞導(dǎo)致了RNA洗脫困難。如果完全按照通用型總RNA提取試劑盒的操作步驟（試劑盒配套有DNase I供柱上消化使用）操作，不僅可以提高RNA的洗脫效率，還能完全去除掉基因組DNA。

3） 對(duì)于動(dòng)物組織/培養(yǎng)細(xì)胞總RNA試劑盒，在做RNA柱純化之前，先用過(guò)濾柱去除了大部分的基因組DNA（從電泳圖上可以看出，在細(xì)菌細(xì)胞沒(méi)有過(guò)量的前提下，基因組DNA去除還是挺干凈的），獲得的濾液主要都是RNA，所以RNA的洗脫效率高，最終得到的RNA濃度最高，并且DNA的殘留也最少。

 六、 結(jié)論

細(xì)菌經(jīng)溶菌酶破壁處理后的結(jié)構(gòu)與培養(yǎng)細(xì)胞非常類似，因此本次測(cè)試還是有參考價(jià)值的。綜上所述，在細(xì)胞數(shù)量較少的情況下（參考試劑盒說(shuō)明書中的細(xì)胞用量下限），強(qiáng)烈推薦使用Simgen動(dòng)物組織/培養(yǎng)細(xì)胞總RNA試劑盒（Simgen Cat.No.5001050），不僅操作步驟簡(jiǎn)單，RNA的回收量也最高，并且去除DNA也快速高效。細(xì)胞數(shù)量中等（參考試劑盒說(shuō)明書中的細(xì)胞用量上限）的情況下，推薦使用通用型總RNA提取試劑盒（Simgen Cat.No.5010050），性價(jià)比很高，雖然步驟復(fù)雜一點(diǎn)，但是DNA去除比較干凈。如果細(xì)胞數(shù)量很多，并且無(wú)法精確估算樣本中細(xì)胞數(shù)量的前提下，推薦使用超純總RNA提取試劑盒（Simgen Cat.No.5003050），雖然然RNA得率低一點(diǎn)，但是酸性酚萃取RNA的方法能有效地同步去除變性的蛋白雜質(zhì)和基因組DNA，避免出現(xiàn)純化柱堵塞等問(wèn)題。