糞便DNA保存液作為Simgen的熱銷(xiāo)產(chǎn)品深受用戶喜愛(ài)，咨詢的客戶也很多，之前就有客戶問(wèn)到產(chǎn)品介紹中描述的“糞便樣本中的DNA經(jīng)糞便保存液穩(wěn)定后可在室溫（15-25℃）保存6個(gè)月以上而免于降解”有沒(méi)有具體的數(shù)據(jù)資料。當(dāng)時(shí)分光光度計(jì)的檢測(cè)數(shù)據(jù)有記錄，但是電泳圖并沒(méi)有保存，而且當(dāng)時(shí)取樣量不多，只做了26周測(cè)試，后面就因?yàn)闃颖静粔蚨鵁o(wú)法繼續(xù)進(jìn)行下去了。為了提供完整可信的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以及探究糞便DNA能不能保存更久的時(shí)間，小新采集了樣本進(jìn)行了糞便DNA保存液保存效果的長(zhǎng)期測(cè)試。

 

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/span>

測(cè)試糞便DNA在Simgen糞便DNA保存液中長(zhǎng)時(shí)間保存的效果。

 

實(shí)驗(yàn)材料：

新鮮采集的人糞便、糞便DNA保存液（Simgen Cat.No.4103050）、糞便DNA純化試劑盒（配套糞便DNA保存液）（Simgen Cat.No.4111050）

超微量電子天平（DENVER INSTRUMENT，TP-213）

旋渦振蕩器（越新儀器，XH-C）

電熱恒溫培養(yǎng)箱（上虞市滬越儀器設(shè)備廠，DHG 303-0）

電子恒溫不銹鋼水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）

臺(tái)式離心機(jī)（eppendorf Centrifuge 5415 D）

超微量分光光度計(jì)（Simgen Cat.No.sim100）

電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-6C型 ）

 

實(shí)驗(yàn)方法：

小新于2022年9月19日采集了5 g糞便樣本，加入了10 ml糞便DNA保存液，旋渦振蕩直至糞便顆粒全部分散溶解后，置于37℃恒溫箱保存至今（除了過(guò)年和十一長(zhǎng)假，其他時(shí)間恒溫箱一直開(kāi)啟），期間每隔一段時(shí)間提取一次DNA。

 

DNA提取操作步驟如下：

1. 將吸頭尖端剪掉，從糞便DNA保存液保存的糞便樣本中吸取100 μl懸濁液，轉(zhuǎn)移到自備的1.5 ml離心管中。

2. 加入350 μl 70℃溫育的Buffer HST，蓋上管蓋，混合均勻，70℃水浴5分鐘。

3. 12000 rpm離心1分鐘。

4. 吸取20 μl蛋白酶K貯存液，加入到一個(gè)1.5 ml離心管管底。

5. 吸取200 μl步驟3中的離心上清加入到該1.5 ml離心管中。

6. 加入200 μl Buffer SL，旋渦振蕩約15秒混勻。將離心管置于70℃水浴10分鐘。

7. 加入200 μl無(wú)水乙醇，溫和地翻轉(zhuǎn)4~6次混和均勻。低速離心數(shù)秒使管蓋上的溶液沉降到管底。

8. 吸取步驟7中的混合液加入到核酸純化柱中（核酸純化柱置于2 ml離心管中），蓋上管蓋，離心棄濾液。

9. 依次用500 μl Buffer WA和600 μl Buffer WB洗滌純化柱。

10. 高速空離去除殘留液體。

11. 棄2 ml離心管，將核酸純化柱置于一個(gè)潔凈的1.5 ml離心管中，在純化柱的膜中央加入150 μl 70℃溫育的Buffer TE，蓋上管蓋，室溫靜置1分鐘，離心得到DNA。

 

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、在超微量分光光度計(jì)上用試劑盒內(nèi)的Buffer TE調(diào)零，測(cè)量洗脫下來(lái)的DNA，結(jié)果如下：

2、在1%的瓊脂糖凝膠上，加入5 μl洗脫的DNA進(jìn)行電泳，結(jié)果如下：

分析與討論：

1. 糞便樣本經(jīng)糞便DNA保存液處理后，置于37℃保存至今已達(dá)16個(gè)月，從分光光度計(jì)測(cè)量結(jié)果來(lái)看，每次均成功提取到了DNA，不過(guò)濃度略有跳動(dòng)，總體趨勢(shì)上看似乎放得越久濃度越高。

2. 經(jīng)過(guò)電泳檢測(cè)分析，當(dāng)天提取的糞便DNA濃度偏高，應(yīng)該是由于樣本剛采集，提取到的糞便DNA中混有一些降解的RNA提高了OD₂₆₀的吸收值，這與OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值接近2.0也有對(duì)應(yīng)關(guān)系。

3. DNA提取的濃度隨糞便樣本室溫放置的時(shí)間延長(zhǎng)濃度有升高現(xiàn)象，這是出乎意料的結(jié)論。經(jīng)過(guò)認(rèn)真分析我們認(rèn)為是以下三個(gè)原因所導(dǎo)致：

1） 糞便DNA保存液保存糞便DNA的過(guò)程中在緩慢地溶解細(xì)菌，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，釋放到保存液中的DNA就越多，在后續(xù)提取DNA的離心步驟（步驟3）中被沉淀丟失的DNA就會(huì)越少，顯示出DNA的回收量就越高。

2） 在37℃存放的條件下，釋放到糞便DNA保存液中的DNA還是會(huì)緩慢地分解的：這個(gè)從電泳分析圖中就可以觀察到，存放1~4個(gè)月的樣本中提取的DNA拖尾做少，在存放5~16個(gè)月的樣本中提取的DNA中，比較明顯的拖尾就觀察到了。DNA的片段越小，相對(duì)而言OD260的吸收值就越高，造成了提取的DNA濃度偏高的假象。

3） 最后我們發(fā)現(xiàn)，隨著37℃放置時(shí)間的延長(zhǎng)，水分會(huì)有部分被蒸發(fā)，這就相當(dāng)于糞便DNA保存液被濃縮了，這很可能是16個(gè)月存放的樣本提取到的DNA濃度有明顯提高的主要原因。

4. 好消息就是：經(jīng)Simgen糞便DNA保存液保存的糞便，在為期16個(gè)月的測(cè)試中，糞便DNA雖然產(chǎn)生了一些拖尾，但是基因組DNA的主條帶依舊清晰可見(jiàn)，無(wú)需擔(dān)心后續(xù)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用。

綜上所述，我們可以得出結(jié)論，糞便樣本中的DNA經(jīng)Simgen糞便DNA保存液穩(wěn)定后至少可在37℃保存16個(gè)月而免于降解。如果將該樣本存放到2~8℃，毫無(wú)疑問(wèn)疑問(wèn)保存時(shí)間可以延長(zhǎng)到2~3年。至于加了Simgen糞便DNA保存液的糞便樣本在常溫是否還能保存更久，小新會(huì)將測(cè)試繼續(xù)下去，敬請(qǐng)期待。