對(duì)于從事分子生物學(xué)的研究的實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)，質(zhì)粒抽提幾乎是每天都用做的常規(guī)技術(shù)。最近，杭州新景生物技術(shù)部常收到來(lái)自童鞋們的各種求助，像質(zhì)粒提取失敗了、不是自已想要的那個(gè)質(zhì)粒及提取得率低等等。

 哈哈~關(guān)于這些問(wèn)題，小編覺(jué)得呢，其實(shí)提取質(zhì)粒并不難，基本上按照質(zhì)粒提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)，小心操作，一般不會(huì)有問(wèn)題。但是為什么還會(huì)有這些問(wèn)題存在？因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)中我們應(yīng)該注意一些我們經(jīng)常忽略的細(xì)節(jié)。可能實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境的污染，操作時(shí)的不注意都會(huì)造成我們培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)染雜菌，使得在質(zhì)粒的提取過(guò)程中現(xiàn)象出現(xiàn)異常，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)不成功。說(shuō)到這里，有些童鞋可能會(huì)問(wèn)：那我們?nèi)镜碾s菌是什么菌呢？其實(shí)大部分為真菌，也有可能是革蘭氏陽(yáng)性菌如金黃色葡萄球菌等。

為了讓大家能能判斷出所用的菌體是否染雜菌，繼而能從實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象可以判斷出該原因，小編特意在本實(shí)驗(yàn)室里做了一個(gè)從染雜菌的細(xì)菌中提取質(zhì)粒的對(duì)照模擬實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)方案

實(shí)驗(yàn)步驟

根據(jù)simgen快速質(zhì)粒DNA小量試劑盒的說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（一）  Buffer II裂解不完全

如上圖所示1、2號(hào)為正常的大腸桿菌加入BufferII后溶液變粘稠的澄清液體；而部分染菌的細(xì)菌3、4號(hào)變?yōu)?span >粘稠的渾濁液體；全為雜菌的5、6號(hào)加入之后溶液呈不粘稠的渾濁液體。

 在加入Buffer II時(shí)，其中的堿性溶液能使革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁破裂以及蛋白質(zhì)變性，從而釋放出質(zhì)粒DNA、基因組DNA等細(xì)胞內(nèi)容物。對(duì)于1、2號(hào)正常的革蘭氏陰性細(xì)菌，Buffer II溶液能將其細(xì)胞壁破裂，釋放出質(zhì)粒DNA等細(xì)胞內(nèi)容物從而溶液變?yōu)檎吵淼某吻逡后w，而3、4號(hào)，我們可以看到它出現(xiàn)了粘稠的渾濁液體，這是因?yàn)?/span>Buffer II溶液能溶解正常的革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞但部分雜菌（革蘭氏陽(yáng)性菌、真菌）的細(xì)胞壁卻不能破裂，不能被破裂的雜菌呈現(xiàn)渾濁狀。5、6號(hào)都為雜菌，它們的細(xì)胞壁較厚，Buffer II溶液只能裂解很小部分的細(xì)胞壁使其穿孔而泄露部分核酸（主要是RNA），細(xì)胞內(nèi)的基因組DNA等其他細(xì)胞內(nèi)容物難以釋放，所以它呈現(xiàn)了不粘稠的渾濁狀。

（二）拷貝數(shù)降低或質(zhì)粒丟失

圖2

如上圖所示1、2號(hào)正常細(xì)菌濃度平均在545ng/μl左右，而3、4號(hào)染雜菌的細(xì)菌濃度平均在340ng/μl左右，較1、2號(hào)正常的細(xì)菌濃度有明顯的降低，這是因?yàn)殡s菌不含質(zhì)粒DNA，故相同細(xì)菌量時(shí)，所得的質(zhì)粒DNA就減少了；而全部為雜菌的5、6號(hào)則濃度最低，平均為83ng/μl。看到這里同學(xué)們可能就有疑問(wèn)了那為什么雜菌也會(huì)有濃度呢？這是因?yàn)?/span>Buffer II溶液對(duì)雜菌的細(xì)胞壁仍有腐蝕作用，但是只能溶解部分的細(xì)胞壁使其穿孔而泄露部分核酸（主要是RNA），而濃度值主要是因?yàn)橛?/span>RNA殘留。

在我們平時(shí)轉(zhuǎn)接菌液時(shí)，很多同學(xué)或?qū)嶒?yàn)室人員為了方便會(huì)多次轉(zhuǎn)接我們要用的菌液。其實(shí)這是個(gè)嚴(yán)重的不規(guī)范操作行為，會(huì)很容易造成雜菌污染，因?yàn)槊看伍_(kāi)蓋轉(zhuǎn)接都會(huì)存在染雜菌的風(fēng)險(xiǎn)，多次開(kāi)蓋會(huì)使染雜菌的風(fēng)險(xiǎn)增大，一旦染雜菌后就會(huì)對(duì)這次以及以后的實(shí)驗(yàn)會(huì)產(chǎn)生影響，即在一次次的轉(zhuǎn)接時(shí)雜菌長(zhǎng)時(shí)間在培養(yǎng)液中，大量傳代，以至于它們?cè)谂囵B(yǎng)液中的比重加大，造成在隨后的質(zhì)粒抽提等的實(shí)驗(yàn)中影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，會(huì)產(chǎn)生最后所提的質(zhì)粒得率降低等問(wèn)題。

 （三）  從電泳圖的亮暗來(lái)判斷

圖3

如上圖所示1、2號(hào)正常細(xì)菌條帶亮于染雜菌的3、4號(hào)細(xì)菌，而全為雜菌的5、6號(hào)則看不到條帶，因?yàn)樗缓|(zhì)粒。

看到這里童鞋們可能會(huì)問(wèn)那怎么避免細(xì)菌培養(yǎng)中長(zhǎng)雜菌呢，那就需要童鞋們?cè)趯?shí)驗(yàn)的過(guò)程中注意細(xì)節(jié)，保證在無(wú)菌環(huán)境下操作且用到的東西都事先滅菌；控制細(xì)菌過(guò)夜培養(yǎng)時(shí)間；每次接種細(xì)菌都從新鮮制備或劃線的平板中挑取單菌落接種；并且在質(zhì)粒抽提前仔細(xì)閱讀試劑盒說(shuō)明書(shū)后進(jìn)行操作；注意這些細(xì)節(jié)小編相信實(shí)驗(yàn)一定會(huì)成功的~

好了，今天就說(shuō)到這里了，小編下次繼續(xù)和大家聊“質(zhì)粒的那些事兒”，同時(shí)大家可以關(guān)注新景生物實(shí)驗(yàn)室（極簡(jiǎn)生物），定期有驚喜哦~請(qǐng)留意更新哦！

                                                                                                                                                                                    杭州新景生物實(shí)驗(yàn)室

                                                                                                                                                                                           2016年1月11日