Hi大家好，實(shí)驗(yàn)做完了的小新閑來無事，那么今天我們來聊一聊最普通最常見最基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)——電泳?！静挪皇菫榱搜陲椥⌒率切率值氖聦?shí)o(￣ヘ￣o＃)

說起跑電泳，肯定有小白們嗤之以鼻：哎呀！這個(gè)跑電泳還不簡(jiǎn)單啊，做塊膠，上個(gè)樣，插上電源跑就是了。講道理，你要是也這么想是會(huì)被打的你造嗎？

作為讀書少的的小新，今天將會(huì)向大家展示實(shí)驗(yàn)室這些年跑電泳所遇到的一些問題，并為大家分析不同電泳圖的所代表的結(jié)果以及在如何解決這些問題，希望對(duì)大家做出漂亮的電泳圖有所幫助。

一、做一塊優(yōu)質(zhì)的瓊脂糖凝膠

正所謂“工欲善其事，必先利其器”，能否做一塊好的瓊脂糖凝膠，直接影響到后面的電泳和結(jié)果的分析。小新一開始跑電泳的時(shí)候，會(huì)出現(xiàn)各種各樣奇怪的圖，作為實(shí)力的典范，先給大家展示一下【(>﹏<。)

圖一                             圖二

從圖一上看，DNA電泳時(shí)，DNA條帶好像遇到阻礙而發(fā)生了扭曲；圖二中DNA亮帶雖沒有發(fā)生扭曲，但是卻出現(xiàn)了雜斑亮帶。這是因?yàn)樵谥颇z時(shí)帶入了其它雜質(zhì)，形成了障礙物，使得DNA條帶電泳時(shí)受到阻礙無法繼續(xù)電泳，從而形成扭曲帶（如圖一）；或者是制膠時(shí)溶膠不完全以致瓊脂糖顆粒殘留，形成一些濃度較高的凝膠區(qū)域，在DNA電泳經(jīng)過這些區(qū)域時(shí)，部分DNA被阻礙在這里而形成不規(guī)則亮帶（如圖二）。

所以小新建議在制膠時(shí)注意以下幾點(diǎn)：

1. 在制膠時(shí)必須將制膠模具、梳子以及燒杯等物品洗凈，以免干膠及其他雜質(zhì)帶入；

2. 在溶膠時(shí)應(yīng)觀察溶液中是否有未溶解的瓊脂糖顆粒，確保溶膠完全；

3. 在溶液倒入制膠模具前必須充分混勻，以免制出來的膠出現(xiàn)不均勻的現(xiàn)象。

二、選擇合適濃度的瓊脂糖凝膠

    除了以上這種低級(jí)問題，還有一個(gè)容易忽略的問題，那就是凝膠的濃度。比如：

     1  2  3  4  5           1  2  3  4  5

圖三                     圖四

當(dāng)師兄告訴我，以上這兩幅圖是用相同的DNA Ladder、上樣量、電泳電壓并且跑了一樣長(zhǎng)的時(shí)間時(shí)，小新的內(nèi)心是崩潰的?。。樯恫顒e非常明顯？哪里不一樣呢？就是由于采用了不同濃度的凝膠電泳而導(dǎo)致的。那怎么選擇合適濃度的瓊脂糖凝膠呢？簡(jiǎn)而言之，長(zhǎng)片段的DNA選用低濃度的凝膠電泳，短片段的DNA則選用高濃度的凝膠電泳--具體參考方案參考下表：

表一：分離不同大小的DNA片段所用的最適凝膠濃度

三、選擇合適的核酸上樣量電泳

除此以外DNA上樣量的多少也會(huì)影響電泳效果。

圖五                                                 圖六

圖五是同一基因組DNA，圖六是同一質(zhì)粒DNA，但是因?yàn)椴煌纳蠘恿?，?dǎo)致了不一樣的電泳效果。經(jīng)驗(yàn)告訴小新：要想電泳跑出可見條帶的話，至少需要上樣50 ng，但是0.5 cm寬的梳子最好不超過加0.5μg的DNA量，因?yàn)樯蠘恿窟^多會(huì)造成加樣孔超載，從而導(dǎo)致拖尾或彌散，對(duì)于較長(zhǎng)的DNA此現(xiàn)象更為明顯。當(dāng)然啦，加樣量的多少還應(yīng)依據(jù)加樣孔的大小及DNA片段的長(zhǎng)度而定，當(dāng)加樣孔大時(shí)，樣品上樣量應(yīng)相應(yīng)加大。

四、選擇合適的電壓電泳

圖七                                             圖八

圖七和圖八是同一樣本跑出的圖，但是出來的效果差別非常大，主要是因?yàn)殡娪緯r(shí)的電壓不同。圖七由于電泳的電壓過大，導(dǎo)致電泳條帶都扭曲變形了(當(dāng)實(shí)驗(yàn)使用GoldView Ⅱ型核酸染色劑時(shí)差別更明顯）。通常情況下電壓越低，走出的電泳條帶越平整。低電壓電泳時(shí)，電泳緩沖液也不容易發(fā)燙，也能確保在電泳的過程中凝膠不會(huì)變形。當(dāng)然電壓太低，等待電泳結(jié)果的時(shí)間就會(huì)延長(zhǎng)，綜合考慮，一般控制電泳電壓≤5V/cm，即可保證電泳條帶的清晰度。

五、選擇合適的電泳距離（控制電泳時(shí)間）

圖九                                                            圖十

最后的這兩幅圖是同一塊凝膠在電泳的不同時(shí)間段拍攝的電泳圖。大家有沒有覺得圖九的電泳條帶還行呢，有主帶，雖然有彌散、拖尾條帶，但是主帶還是很亮的。如果只是看有沒有核酸的話，差不多就蒙混過去了，但是如果你是想看DNA狀態(tài)或者是分離不同長(zhǎng)度片段的DNA，那么必須多跑一會(huì)兒，這樣就有了圖十。圖十可以看出有基因組DNA、質(zhì)粒DNA以及RNA。

為什么差別那么大？這是因?yàn)閳D九電泳的時(shí)間短，不同長(zhǎng)度片段的DNA條帶還未分離，都聚集在一起，所以只能看見DNA含量最高的主帶；而圖十的電泳時(shí)間比較長(zhǎng)，不同長(zhǎng)度片段的DNA條帶已經(jīng)分離，可以清晰看到不同長(zhǎng)度片段的DNA條帶，甚至兩最下方的兩條RNA條帶都被分離開了。

    當(dāng)然啦對(duì)于一些片段的DNA，電泳20-30min家常便飯，有的甚至需要更長(zhǎng)的時(shí)間，如果想稍微快一點(diǎn)，可以選用濃度比較稀的凝膠或稍微調(diào)高一點(diǎn)電壓進(jìn)行電泳，但是要有一定的范圍（所需凝膠濃度見表一）。

好啦，今天的小新課堂又要和大家說再見啦，本期討論的內(nèi)容比較多，但好在淺顯易知，小新也只是拋磚引玉，如果大家有什么不同的看法建議，或者想討論的話題，歡迎給小新來信。我們下期再會(huì)！

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