我們之前碰到過(guò)一些客戶，說(shuō)做PCR實(shí)驗(yàn)總是出現(xiàn)假陽(yáng)性，明明沒(méi)有加模板最后卻擴(kuò)出了產(chǎn)物。如果這種現(xiàn)象頻頻出現(xiàn)，就要注意一下操作環(huán)境了。如果你去百度上搜索“PCR出現(xiàn)假陽(yáng)性了怎么辦”，下面給出的建議一定會(huì)有防止交叉污染這條建議。有人說(shuō)模板DNA是大分子，溶于去離子水中，怎么會(huì)無(wú)緣無(wú)故跑出來(lái)污染環(huán)境呢？小編將會(huì)一一解釋。

這里涉及一個(gè)氣溶膠的概念，氣溶膠是由固體或液體小質(zhì)點(diǎn)分散并懸浮在氣體介質(zhì)中形成的膠體分散體系，能在空氣中滯留至少幾個(gè)小時(shí)。PCR反應(yīng)過(guò)程中不斷進(jìn)行升溫降溫，液體蒸發(fā)又冷凝，PCR管中空氣的部分形成了氣溶膠，攜帶了大量DNA擴(kuò)增產(chǎn)物（注意1ng擴(kuò)增產(chǎn)物中可作為模板的DNA片段的數(shù)量超過(guò)1ng起始模板中可擴(kuò)增DNA片段數(shù)量的幾百萬(wàn)倍甚至更高。比如人的基因組DNA有30億個(gè)bp，要擴(kuò)增的單拷貝基因片段是300 bp，1ng起始模板中可以作為模板DNA片段只占總起始模板DNA總量的千萬(wàn)分之一）。如果在實(shí)驗(yàn)室打開(kāi)含PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的管蓋，大量攜帶DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的氣溶膠就會(huì)涌出，擴(kuò)散到空氣中，從而對(duì)環(huán)境造成污染。雖然在整個(gè)空間環(huán)境中DNA的含量很低，但是由于理論上只要有1個(gè)可做為模板的DNA 片段也能PCR擴(kuò)增成功，這就是為什么在污染環(huán)境中陰性對(duì)照也能擴(kuò)增出條帶的原因。

所以在專(zhuān)業(yè)的PCR實(shí)驗(yàn)（比如臨床PCR檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室）室通常有四區(qū)隔離（或至少是三區(qū)隔離）的要求。

常見(jiàn)的三區(qū)指的是：

1、試劑配制區(qū)：PCR反應(yīng)體系的配制區(qū)域。

2、標(biāo)本處理區(qū)：包括擴(kuò)增模板的制備，也就是我們常常提取DNA的地方；

3、PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū)：進(jìn)行PCR擴(kuò)增的區(qū)域，也是擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析的區(qū)域。

如果將PCR擴(kuò)增區(qū)域和產(chǎn)物分析區(qū)再次分開(kāi)，就是四區(qū)隔離了。

四區(qū)隔離，主要目的是防止氣溶膠在各個(gè)PCR區(qū)域之間的流動(dòng)—最好的方法是干脆每個(gè)區(qū)域隔一幢樓，那肯定是最佳的隔離措施了，但操作起來(lái)肯定不現(xiàn)實(shí)，于是便有了針對(duì)不同區(qū)域設(shè)置正負(fù)壓的方法：

試劑配制區(qū)（Ⅰ區(qū)）：最潔凈的區(qū)域，保持微正壓使得外界空氣無(wú)法進(jìn)入隔離污染源。并且陰性模板應(yīng)該在此區(qū)加入PCR管并蓋蓋，嚴(yán)禁在此區(qū)域打開(kāi)、存放裝有DNA模板的離心管；

DNA模板添加區(qū)（Ⅱ區(qū)）：保持微負(fù)壓，保證內(nèi)部空氣不外泄，以免陽(yáng)性模板的氣溶膠對(duì)外界環(huán)境造成污染。

擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物分析區(qū)（Ⅲ區(qū)）：保持微負(fù)壓，使得內(nèi)部空氣不外泄，以免擴(kuò)增產(chǎn)物的氣溶膠對(duì)外界環(huán)境造成污染。

操作時(shí)遵循Ⅰ區(qū)→Ⅱ區(qū)→Ⅲ區(qū)單一方向進(jìn)行，不可逆向進(jìn)行。

對(duì)于科研用途的PCR實(shí)驗(yàn)室，如果無(wú)法達(dá)到嚴(yán)格的三區(qū)隔離的要求，至少也要做到兩區(qū)隔離：即正壓區(qū)和負(fù)壓區(qū)。正壓區(qū)實(shí)施Ⅰ區(qū)的功能，負(fù)壓區(qū)實(shí)施Ⅱ區(qū)，Ⅲ區(qū)的功能。

最忌諱也是最可怕的是反過(guò)來(lái)，在正壓區(qū)實(shí)施Ⅲ區(qū)的功能。我們有個(gè)用戶的所有實(shí)驗(yàn)室都是正壓—因?yàn)檫M(jìn)入實(shí)驗(yàn)室的空氣都是經(jīng)過(guò)過(guò)濾的。他信心滿滿地認(rèn)為他們的實(shí)驗(yàn)室超干凈，做PCR絕對(duì)沒(méi)問(wèn)題，但他們實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)了最嚴(yán)重的PCR產(chǎn)物污染問(wèn)題—所有的陰性對(duì)照都是陽(yáng)性。所以PCR實(shí)驗(yàn)室的潔凈度是次要的，不同區(qū)域間的空氣是互相之間否有流通才是最關(guān)鍵的。

如果有的同學(xué)問(wèn)，我們的實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有正負(fù)壓的區(qū)分，或者是全負(fù)壓，全正壓怎么辦呢？那我們的建議是：別怕麻煩，找個(gè)遠(yuǎn)離Ⅲ區(qū)（通俗地講就是打開(kāi)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的蓋子區(qū)域，比如電泳區(qū)）的實(shí)驗(yàn)室當(dāng)做PCR I區(qū)使用，能省掉后續(xù)更多的麻煩。

既然PCR三區(qū)隔離的目的是為了阻斷氣溶膠的交流，請(qǐng)注意以下細(xì)節(jié)，思考一下氣溶膠來(lái)自哪里：

1. 每個(gè)區(qū)域都應(yīng)配備專(zhuān)用的移液器，不可交叉混用。我們的一位用戶拿電泳室的移液器加模板，陰性對(duì)照擴(kuò)出了很亮的條帶。

2. 每個(gè)區(qū)域都應(yīng)配備專(zhuān)用的移液器吸頭，不可交叉混用。

3. 如果條件允許，在PCRⅢ區(qū)工作結(jié)束后再次進(jìn)入PCR I區(qū)需要更換實(shí)驗(yàn)服、一次性鞋套、帽子、手套。

4. 在PCR I區(qū)、PCRⅡ區(qū)配備帶濾芯吸頭。

很多做PCR的同學(xué)會(huì)將做PCR的吸頭滅菌、或者是在超凈臺(tái)做PCR操作。但在小編看來(lái)這完全沒(méi)有必要，因?yàn)樽龊肞CR最重要的是防止擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，而不是無(wú)菌操作！試想一下，高壓滅菌了又如何，DNA并不會(huì)因此而降解多少，如果細(xì)菌的DNA會(huì)參與PCR擴(kuò)增，那么無(wú)論活菌或是細(xì)菌尸體都一樣能擴(kuò)增出DNA 條帶。

                                                                                                              新景實(shí)驗(yàn)室