我們先來看網(wǎng)絡(luò)上的一個求助帖：

已經(jīng)積攢了一批抗凝血，由于當時未多加考慮,取標本后就直接放在-80度了，請問:

這樣對提取RNA影響大嗎？我該怎樣防止血液融化時RNA被酶解呢？具體該怎樣操作呢？
謝謝。我是新手，請多幫助!!!!
回復(fù)1：凍存的時間過長，即使溫度很低，RNA也可能降解。你的這種情況，在融解之前在凍塊上面加入RNA酶抑制劑溶液后再融解，融解過程中注意抑制劑溶液及時與融化血液混合，不要劇烈振蕩。只要RNA在凍存過程沒有降解，這樣就不會有太大問題。
回復(fù)2：這樣不可避免RNA的降解。我們也遇到這樣的問題，我們的首席教授告訴我們應(yīng)該在凍存時直接加入TRIZOL。這樣可以避免RNA被降解。
回復(fù)
非常感謝！只有提提試一下了。
RNA酶抑制劑溶液是指的什么？1 ml血液加多少有要求嗎？

從上面的求助帖中我們可以總結(jié)出幾大信息：

1. 血液直接凍存到-80℃再提取是個大問題，沒有人能確切回復(fù)可行的操作方案。實際上即使我們查找著名的核酸純化試劑盒公司QIAGEN的網(wǎng)站，也找不到從-80℃凍存的血液中提取RNA的方法。

2. 血液不加任何試劑直接凍存在-80℃時，RNA會降解嗎？如果會降解，多久會降解完？

3. 回復(fù)的建議都是猜測性的，沒有做過實際的測試。

眾所周知，RNA容易降解，所以一般提取RNA都會使用新鮮的樣本，如果新鮮樣本不能立即提取RNA，應(yīng)立即放到-80℃凍存—從這一點上講，發(fā)帖的求助者也沒做錯。但關(guān)鍵是血液中的紅細胞不含有RNA，提供RNA的主要是白細胞，市面上主要的血液RNA提取試劑盒（比如QIAGEN）用到的原理是將白細胞與其它組分分離（用紅細胞裂解液去除紅細胞）再提取其中的RNA。一旦血液經(jīng)過冷凍就會出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，這時所有的細胞都發(fā)生破裂，已經(jīng)無法分離白細胞了，使用這種方法自然也就提不到RNA。

Simgen獨創(chuàng)的全血總RNA試劑盒，是無需紅細胞裂解液分離白細胞，直接從全血中提取RNA的，是不是能從冷凍的抗凝血中提取到RNA呢？讓我們實測一下吧：

一、實驗材料：

-80℃冷凍75天的抗凝全血；預(yù)先按500 μl血樣比1 ml Buffer L9的比例加入Buffer L9的同一個抗凝全血樣本作為對照組（備注：Simgen 全血總RNA試劑盒中的Buffer L9與抗凝全血預(yù)混后可在-20℃長期凍存，RNA不會降解）。

二、實驗試劑：

全血總RNA試劑盒（simgen，Cat.No.5201050）、cDNA第一鏈合成試劑盒（simgen，Cat.No.7306025）、2×SYBR Green PCR Mix（simgen，Cat.No.7106100）、

人β-actin引物（Forward TGACGTGGACATCCGCAAAG/Reverse：  CTGGAAGGTGGACAGCGAGG）

三、實驗方法：

1. 分兩組進行對比實驗，每組各做兩管：第一組取2個2 ml離心管，各加入500 μl新鮮全血，編號1、2；第二組加入500 μl新鮮全血后再加入1 ml Buffer L9，混合均勻，編號3、4。將兩組樣本置于-80℃凍存，凍存75天。

2. 75天后取出后置于室溫，待血樣全部融化后，向1、2中加入1 ml Buffer L9混合均勻；

3. 13000 rpm離心10分鐘；

4. 吸取700 μl離心上清轉(zhuǎn)移到裝有500 μl無水乙醇的1.5 ml 離心管中，混勻；

5. 分兩次將混合液轉(zhuǎn)移到核酸純化柱中，離心去濾液；

6. 依次用500 μl Buffer WA和700 μl Buffer WBR各洗滌一次；

7. 用50 μl RNase-Free Water洗脫RNA；

8. 在微量紫外分光光度計上測量RNA的濃度；

9. 瓊脂糖凝膠電泳；

10. 逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA；

11. 取5 μl cDNA模板進行RT-PCR檢測。

四、實驗結(jié)果：

1、 在微量紫外分光光度計上用RNase-Free Water調(diào)零，測量洗脫下來的RNA，結(jié)果如下

表1

2、在1%的瓊脂糖凝膠上，加入8 μl血液RNA，電泳15 min，結(jié)果如下

圖一：瓊脂糖凝膠電泳圖

M：DL 2000 Ladder DNA Marker

1、2：500 μl冷凍抗凝全血提取的RNA

3、4：500 μl抗凝全血加1 ml Buffer L9預(yù)先混合后提取的RNA

從圖一所示的電泳圖中可以看出，四個樣本的電泳條帶都很清晰。

3、熒光定量PCRβ-actin基因檢測結(jié)果

圖二：RT-PCR曲線（Delta Rn vs Cycle）

陰性：無菌超純水                   3、4：500 μl抗凝全血加1 ml Buffer L9預(yù)混對按照

從圖二可以看出，兩組不同處理的冷凍全血中提取的RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后獲取的cDNA在RT-PCR檢測中幾乎與陽性同時起線，且Ct值較靠前。

從本次實驗可以得出結(jié)論：由于Simgen全血總RNA試劑盒可以從血液中直接分離純化總RNA，不需事先分離白細胞，自然也不怕冷凍血液溶血。本次實驗測試，一次可以從500 μl -80℃貯存75天的冷凍全血中提取到3 μg左右的血液總RNA，且純度很高，完全滿足后續(xù)基因檢測的需要。

最后我們可以對網(wǎng)絡(luò)上的求助帖做幾條有價值的回復(fù)了：

1. 在-80℃凍存的抗凝全血，如果用Simgen全血總RNA純化試劑盒提取RNA則結(jié)果影響不大。

2. 抗凝全血在-80℃凍存時間小于75天的，提取到的RNA尚未觀察到有嚴重的降解。

3. 解凍后的抗凝全血立即用Simgen全血總RNA純化試劑盒提取RNA，即使不加RNA酶抑制劑，RNA也不會被降解。

對具體操作感興趣的同學，也可以點擊觀看視頻：https://v.qq.com/x/page/g0323yn2iz8.html