我們先來(lái)看網(wǎng)絡(luò)上的一個(gè)求助帖：

已經(jīng)積攢了一批抗凝血，由于當(dāng)時(shí)未多加考慮,取標(biāo)本后就直接放在-80度了，請(qǐng)問(wèn):
這樣對(duì)提取RNA影響大嗎？我該怎樣防止血液融化時(shí)RNA被酶解呢？具體該怎樣操作呢？
謝謝。我是新手，請(qǐng)多幫助!!!!
回復(fù)
凍存的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，即使溫度很低，RNA也可能降解。
你的這種情況，在融解之前在凍塊上面加入RNA酶抑制劑溶液后再融解，融解過(guò)程中注意抑制劑溶液及時(shí)與融化血液混合，不要?jiǎng)×艺袷?。只?/span>RNA在凍存過(guò)程沒(méi)有降解，這樣就不會(huì)有太大問(wèn)題。
回復(fù)
這樣不可避免RNA的降解。
我們也遇到這樣的問(wèn)題，我們的首席教授告訴我們應(yīng)該在凍存時(shí)直接加入TRIZOL。這樣可以避免RNA被降解。
回復(fù)
非常感謝！只有提提試一下了。
RNA酶抑制劑溶液是指的什么？1 ml血液加多少有要求嗎？

從上面的求助帖中我們可以總結(jié)出幾大信息：

1. 血液直接凍存到-80℃再提取是個(gè)大問(wèn)題，沒(méi)有人能確切回復(fù)可行的操作方案。實(shí)際上即使我們查找著名的核酸純化試劑盒公司QIAGEN的網(wǎng)站，也找不到從-80℃凍存的血液中提取RNA的方法。

2. 血液不加任何試劑直接凍存在-80℃時(shí)，RNA會(huì)降解嗎？如果會(huì)降解，多久會(huì)降解完？

回復(fù)的建議都是猜測(cè)性的，沒(méi)有做過(guò)實(shí)際的測(cè)試。

眾所周知，RNA容易降解，所以一般提取RNA都會(huì)使用新鮮的樣本，如果新鮮樣本不能立即提取RNA，應(yīng)立即放到-80℃凍存—從這一點(diǎn)上講，發(fā)帖的求助者也沒(méi)做錯(cuò)。但關(guān)鍵是血液中的紅細(xì)胞不含有RNA，提供RNA的主要是白細(xì)胞，市面上主要的血液RNA提取試劑盒（比如QIAGEN）用到的原理是將白細(xì)胞與其它組分分離（用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞）再提取其中的RNA。一旦血液經(jīng)過(guò)冷凍就會(huì)出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，這時(shí)所有的細(xì)胞都發(fā)生破裂，已經(jīng)無(wú)法分離白細(xì)胞了，使用這種方法自然也就提不到RNA。

Simgen獨(dú)創(chuàng)的全血總RNA試劑盒，是無(wú)需紅細(xì)胞裂解液分離白細(xì)胞，直接從全血中提取RNA的，是不是能從冷凍的抗凝血中提取到RNA呢？讓我們實(shí)測(cè)一下吧：

實(shí)驗(yàn)材料：-80℃冷凍75天的抗凝全血；預(yù)先按500 μl血樣比1 ml Buffer L9的比例加入Buffer L9的同一個(gè)抗凝全血樣本作為對(duì)照組（備注：Simgen 全血總RNA試劑盒中的Buffer L9與抗凝全血預(yù)混后可在-20℃長(zhǎng)期凍存，RNA不會(huì)降解）。

實(shí)驗(yàn)試劑：全血總RNA試劑盒（simgen，Cat.No.5201050）、

cDNA第一鏈合成試劑盒（simgen，Cat.No.7306025）、

2×SYBR Green PCR Mix（simgen，Cat.No.7106100）、

人β-actin引物（Forward TGACGTGGACATCCGCAAAG

/Reverse：  CTGGAAGGTGGACAGCGAGG）

實(shí)驗(yàn)方法：

1. 分兩組進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，每組各做兩管：第一組取2個(gè)2 ml離心管，各加入500 μl新鮮全血，編號(hào)1、2；第二組加入500 μl新鮮全血后再加入1 ml Buffer L9，混合均勻，編號(hào)3、4。將兩組樣本置于-80℃凍存，凍存75天。

2. 75天后取出后置于室溫，待血樣全部融化后，向1、2中加入1 ml Buffer L9混合均勻；

3. 13000 rpm離心10分鐘；

4. 吸取700 μl離心上清轉(zhuǎn)移到裝有500 μl無(wú)水乙醇的1.5 ml 離心管中，混勻；

5. 分兩次將混合液轉(zhuǎn)移到核酸純化柱中，離心去濾液；

6. 依次用500 μl Buffer WA和700 μl Buffer WBR各洗滌一次；

7. 用50 μl RNase-Free Water洗脫RNA；

8. 在微量紫外分光光度計(jì)上測(cè)量RNA的濃度；

9. 瓊脂糖凝膠電泳；

10. 逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA；

11. 取5 μl cDNA模板進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1.在微量紫外分光光度計(jì)上用RNase-Free Water調(diào)零，測(cè)量洗脫下來(lái)的RNA，結(jié)果如下，

從表一的數(shù)據(jù)上可以看出兩種方法處理的抗凝血經(jīng)過(guò)75天的長(zhǎng)期保存后均提取出了RNA，且濃度并無(wú)太大差異。

2.在1%的瓊脂糖凝膠上，加入8 μl血液RNA，電泳15 min，結(jié)果如下，

從圖一所示的電泳圖中可以看出，四個(gè)樣本的電泳條帶都很清晰。

 3.熒光定量PCRβ-actin基因檢測(cè)結(jié)果，

從圖二可以看出，兩組不同處理的冷凍全血中提取的RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后獲取的cDNA在RT-PCR檢測(cè)中幾乎與陽(yáng)性同時(shí)起線，且Ct值較靠前。

從本次實(shí)驗(yàn)可以得出結(jié)論：由于Simgen全血總RNA試劑盒可以從血液中直接分離純化總RNA，不需事先分離白細(xì)胞，自然也不怕冷凍血液溶血。本次實(shí)驗(yàn)測(cè)試，一次可以從500 μl -80℃貯存75天的冷凍全血中提取到3 μg左右的血液總RNA，且純度很高，完全滿足后續(xù)基因檢測(cè)的需要。

最后我們可以對(duì)網(wǎng)絡(luò)上的求助帖做幾條有價(jià)值的回復(fù)了：

1. 在-80℃凍存的抗凝全血，如果用Simgen全血總RNA純化試劑盒提取RNA則結(jié)果影響不大。

2. 抗凝全血在-80℃凍存時(shí)間小于75天的，提取到的RNA尚未觀察到有嚴(yán)重的降解。

3. 解凍后的抗凝全血立即用Simgen全血總RNA純化試劑盒提取RNA，即使不加RNA酶抑制劑，RNA也不會(huì)被降解。

對(duì)具體操作感興趣的同學(xué)，也可以點(diǎn)擊觀看視頻：https://v.qq.com/x/page/g0323yn2iz8.html。

操作視頻

Simgen實(shí)驗(yàn)室

2017.12.02