前幾天，有個客戶詢問如何提取酵母的RNA，小新當(dāng)時(shí)就推薦了超純總RNA提取試劑盒，這個試劑盒的說明書中就有酵母的提取步驟。之后考慮到通用性極強(qiáng)的高多糖多酚植物總RNA試劑盒是不是效果會更好呢，于是決定實(shí)際測試一下。

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

比較高多糖多酚植物總RNA試劑盒與超純總RNA提取試劑盒提取酵母RNA的效果。

實(shí)驗(yàn)材料

新鮮培養(yǎng)的酵母、研缽、高多糖多酚植物總RNA試劑盒（Simgen Cat.No.5103050）、超純總RNA提取試劑盒（Simgen Cat.No.5003050）

超微量電子天平（DENVER INSTRUMENT，TP-213）

旋渦震蕩器（越新儀器，XH-C）

臺式離心機(jī)（eppendorf Centrifuge 5415 D）

超微量分光光度計(jì)（Simgen Cat.No.sim100）

電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-6C型）

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

超純總RNA提取試劑盒提取方法：

1. 將培養(yǎng)的酵母菌離心沉淀?xiàng)壣锨逡?，震蕩懸浮，用移液槍吸?/span>300 mg于研缽中，加入3 ml Buffer TL進(jìn)行研磨。充分研磨后，吸取2管1.1 ml液體于1.5 ml離心管中。

2. 加入200 μl Buffer EX，旋渦震蕩混勻，12000 rpm離心。

3. 吸取600 μl上層水相于新的1.5 ml離心管中，加入同體積70%乙醇，混勻后分兩次加入核酸純化柱中，離心棄濾液。

4. 在核酸純化柱中依次加入500 μl Buffer WA和600 μl Buffer WBR洗滌。

5. 14000 rpm空離1分鐘去除殘留乙醇。

6.將核酸純化柱放于RNase-Free的1.5 ml離心管中，加入50 μl RNase-Free Water，室溫靜置1分鐘，離心洗脫得到酵母RNA。

高多糖多酚植物總RNA試劑盒提取方法：

1. 將培養(yǎng)的酵母菌離心沉淀?xiàng)壣锨逡?，震蕩懸浮，用移液槍吸?/span>300 mg于研缽中，加入1.8 ml已加入β-巰基乙醇的Buffer RCT進(jìn)行研磨。充分研磨后，吸取2管700 μl液體于1.5 ml離心管中。

2. 加入600 μl Buffer EX，旋渦震蕩混勻，12000 rpm離心。

3. 吸取350 μl上清液于新的1.5 ml離心管中，加入同體積Buffer K，混勻后轉(zhuǎn)移到過濾柱過濾。

4. 在濾液中加入700 μl 70%乙醇，混勻后分兩次加入核酸純化柱中，離心棄濾液

5. 在核酸純化柱中依次加入500 μl Buffer WA和600 μl Buffer WBR洗滌。

6. 14000 rpm空離1分鐘去除殘留乙醇。

7.將核酸純化柱放于RNase-Free的1.5 ml離心管中，加入50 μl RNase-Free Water，室溫靜置1分鐘，離心洗脫得到酵母RNA。

將提取到的RNA在超微量分光光度計(jì)上測量濃度和純度，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠RNA電泳檢測。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 在超微量分光光度計(jì)上用RNase Free Water調(diào)零，測量洗脫下來的RNA，結(jié)果如下：

其中1、2為高多糖多酚植物總RNA試劑盒提取的酵母RNA結(jié)果，3、4為超純總RNA提取試劑盒提取的酵母RNA結(jié)果。

2. 在1%的瓊脂糖凝膠上，加入5 μl提取到的RNA，電泳25分鐘，結(jié)果如下：

實(shí)驗(yàn)討論與分析

1. 從測得的濃度分析，高多糖多酚植物總RNA試劑盒提取到的RNA濃度稍高一點(diǎn)。再結(jié)合電泳分析，高多糖多酚植物總RNA試劑盒提取的RNA條帶相對而言亮度更高，也更清晰，而超純總RNA提取試劑盒提取到的RNA條帶亮度則明顯較暗。因此可以推斷出超純總RNA提取試劑盒提取到的RNA實(shí)際濃度可能比分光光度計(jì)測的數(shù)值更低，可能有較高比例的OD₂₆₀吸收值其實(shí)是由小片段RNA所貢獻(xiàn)（見電泳圖泳道4、5底部）。

2. 綜上所述，雖然兩種試劑盒都可從酵母中提出RNA，且濃度和純度單純從分光光度計(jì)上分析都還不錯，但結(jié)合電泳分析，高多糖多酚植物總RNA試劑盒在提取酵母RNA上更勝一籌。

3.之前的一篇文章（實(shí)測SIMGEN高多糖多酚植物總RNA試劑盒強(qiáng)大的通用性）中介紹過，針對那些高多糖多酚樣本，需要使用高多糖多酚植物總RNA試劑盒，用超純總RNA提取試劑盒提取往往會出現(xiàn)一些問題。而酵母細(xì)胞壁的主要成分是甘露聚糖和β-葡聚糖，這兩者都屬于多糖，占了細(xì)胞壁干重的60%，這可能是超純總RNA提取試劑盒的提取效果不如高多糖多酚植物總RNA試劑盒的主要原因。延伸開來分析，一些絲狀真菌的細(xì)胞壁中如果含較高多糖組分的，也應(yīng)該選用高多糖多酚植物總RNA試劑盒提取RNA。