直接法提取DNA  

直接法提取DNA的步驟如下： 

1) 取1 g土樣，倒入滅菌的50mL離心管中 

2) 加入10 mL TENPP緩沖液(20 mmol/L EDTA， 50 mmol/L Tris， 1% PVPP， 100 mmol/L NaCl，pH 10.0)用振蕩儀振蕩數(shù)分鐘，使土樣懸浮并充分混勻

3) 10000 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)洗滌3-5次，至上清基本無色 

4) 加入5 mL PBS緩沖液(2.7 mmol/L KCl， 100 mmol/L NaCl， 2 mmol/L KH2PO4，10 mmol/L Na2HPO4， pH 7.4)漂洗，10000 r/min離心5 min，棄上清

5)加入13.5 mL DNA提取緩沖液(100 mmol/L Tris，100 mmol/L EDTA，100 mmol/L Na3PO4，1.5 M NaCl，1%CTAB， pH 8.0)，混勻后液氮反復(fù)凍溶3次，加入100 μL蛋白酶K(25 mg/mL)和200 μL溶菌酶(50 mg/mL， pH 8. 0)，37℃水浴30 min，期間顛倒混勻3次

6) 加入2 mL 20% SDS，65℃水浴2 h，期間顛倒混勻5-6次

7) 8 000 r/min室溫15 min，取上清至新管

8) 用等體積氯仿：異戊醇(24：1)抽提，吸出水層，加入0.6倍體積的異丙醇，4℃沉淀1 h或更長 

9) 11000 r/min 4℃離心20 min，沉淀DNA

10) 去上清，用70%乙醇漂洗，11000 r/min 4℃離心5 min，并重復(fù)漂洗1次，置于超凈工作臺吹干

11) 干燥后，用100 μL ddH2O(含RNAse 20 mg/mL)溶解，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，37℃放置30 min，置于-20℃冰箱中保存。

間接法提DNA 

間接法提取土壤DNA所用介質(zhì)為Nycodenz，密度梯度離心，步驟如下：

 1) 稱取1 g土樣，倒入已滅菌的50 mL離心管中

 2) 加入15 mL 預(yù)冷無菌蒸餾水，并渦旋混勻

3) 將10 mL Nycodenz (8 g Nycodenz 溶于10 mL滅菌蒸餾水，稍加熱便于溶解)小心泵入土壤懸浮液底部，4℃，11000 r/min離心30 min 

4) 小心收集在下層Nycodenz-土壤顆粒與上層水層分界面顯白色的微生物細(xì)胞層(吸到上層水層對結(jié)果沒有影響)至新管

5)加入13.5 mL DNA提取緩沖液(100 mmol/L Tris，100 mmol/L EDTA，100 mmol/L Na3PO4，1.5 M NaCl， 1%CTAB， pH 8.0)，混勻后液氮反復(fù)凍溶3次，加入100 μL 蛋白酶K (25 mg/mL) 和200 μL溶菌酶(50 mg/mL， pH 8. 0)，37℃水浴30 min，期間顛倒混勻3次 

6) 加入2 mL 20% SDS，65℃水浴2 h，期間顛倒混勻5-6次

7) 8 000 r/min室溫15 min，取上清至新管

8) 用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提，吸出水層，加入0.6倍體積的異丙醇，4℃沉淀1 h或更長

9) 11000 r/min 4℃離心20 min，沉淀DNA

10) 去上清，用70%乙醇漂洗，11000 r/min 4℃離心5 min，并重復(fù)漂洗1次，置于超凈工作臺吹干

11) 干燥后，用100 μL ddH2O(含RNAse 20 mg/mL)溶解，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，37℃放置30 min，置于-20℃冰箱中保存。

SDS 高鹽法

稱取1g土壤，放入研缽中，倒入適量的液氮，立即研磨；再倒入適量的液氮，研磨，重復(fù)3 次，使土壤顆粒研成粉末；

將13.5 ml 提取緩沖液 (0.1 mol/L磷酸鹽 [pH = 8.0 ] ，0.1 mol/L EDTA [pH 8.0 ] ，0.1 mol/L Tris-HCl [pH 8.0 ] ，1.5 mol/LNaCl ，1.0 % CTAB) 和50μl蛋白酶K(10 g/L) 與5 g土壤置于50 ml 的離心管中，放入37 ℃恒溫?fù)u床上，225 r·min -1振蕩30 min ；

加入1.5 ml20 % SDS ，輕輕混勻，65 ℃水浴加熱2 h ，每隔15～30 min 輕輕搖勻1 次；

5 000 r·min- 1 離心10 min ，將上清液轉(zhuǎn)入新的50 ml 離心管中；

取4.5 ml 提取緩沖液加入原離心管，搖勻泥漿，加入0.5 ml 20 % SDS ，65 ℃水浴15 min ，用上述同樣的離心速度離心10min ，將上清液與原上清液合并；

再重復(fù)此步驟1 次；

用與上清液等量的三氯甲烷于離心管中混勻，5000 r·min - 1 離心20 min ；

收集上清液，并加入0.6 倍體積的異丙醇，室溫靜置1 h ；

25 ℃下12 000r·min - 1離心20 min ，倒出上清液，干燥后加入500μl 去離子水，溶解粘附于離心管壁的DNA 及其雜質(zhì)，并收集于1.5 ml 的微型離心管中.

變性劑加SDS 高鹽法

取1 g土樣和等量的滅菌石英砂在研缽中混合，加入1 ml 變性劑(4 mol/L異硫青酸胍，10mmol/L Tris-HCl [pH 7.0 ] ，1 mmol/L EDTA[pH 8.0 ] ，0.5 % 2-巰基乙醇) ；

液氮冰凍，研磨至溶解，重復(fù)3 次；轉(zhuǎn)入50 ml 離心管中，加入9 ml 提取緩沖液(0.1 mol/L磷酸鈉[pH 7.0 ] ， Tris-HCl [ pH 7.0 ] ， 0.1 mol /L EDTA [ pH8.0 ] ，1.5 mol/L NaCl ，1 %CTAB ，2 %SDS) ；

65 ℃水浴1 h ，每10 min 輕輕混勻1 次；5 000 r·min- 1 離心10 min ，取上清；

在原管中加入5 ml 提取緩沖液，混合后，65 ℃水浴10min ，離心，取上清，合入上述上清液；

重復(fù)一次；加入等體積的氯仿混合，5 000 r·min - 1離心20 min ，取上清；

加入0.6 倍體積的異丙醇，室溫沉淀1 h ；20～25 ℃，12 000 r·min - 1離心20 min ，TE 溶解沉淀.

SDS-酚氯仿抽提法

稱取1g 土壤樣品，加入1ml0.1mol/l PH8.0 磷酸緩沖液，玻璃珠振蕩1min。溶菌酶5mg，使終濃度為2.5mg/ml，室溫振蕩15min，放置冰箱30min，加125μl 20%SDS振蕩處理15min，離心，分裝EP管，加酚（1：1體積），抽提1次，氯仿-異戊醇（1：1體積），抽提2次，加0.6體積異丙醇，室溫放置1h，離心，70%乙醇清洗，200μl TE 溶解。

凍融溶菌酶SDS裂解法

取1g土壤樣品，加如0.5ml滅菌的抽提緩沖液（100 mmol/LTris-HCl ， 100 mmol/L EDTA， 200 mmol/L NaCl， 1.0% PVP， 2.0%CTAB ， PH8.0），加玻璃珠旋渦5~10 min，在液氮中冷卻1 min后迅速在沸水中煮2 min，如此重復(fù)3次，13 000r/min離心10 min。上清夜快速置于冰上備用，沉淀用于進(jìn)一步裂解。將上述沉淀懸浮于0.2ml提取緩沖液中，旋渦10min，加入溶菌酶（100ml/l）50μl，輕輕混勻后，37C溫浴30min，再加入250μl SDS 緩沖液（100 mmol/lTris-HCl， 200 mmol/l NaCl，2.0% SDS， PH8.0），上下顛倒10min，13000 r/min離心10min，收集上清夜。