前段時(shí)間為了擴(kuò)展物種源性鑒定試劑盒的種類，決定增加馬源和驢源的鑒定試劑盒。在研發(fā)階段遇到了一些意想不到的事情，今天小新來(lái)和大家分享一下。

一、查閱資料

物種源性鑒定試劑盒采用TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，根據(jù)各物種間基因序列差異而進(jìn)行動(dòng)物源性成分鑒定。本次馬和驢的特異性引物及探針是采用了《SB/T 10923-2012 肉及肉制品中豬、牛、羊、馬、驢、雞、鴨、鵝、兔源性成分的快速鑒定 實(shí)時(shí)PCR法》，具體序列如下：

馬源性成分檢測(cè)用引物（對(duì)）序列為：

FP：5′- CCAATGCGTATTCTGACTCTTAGTG -3′

RP：5′- CGATAATTACGTATGGGTGTTCC -3′

Pro：5′ FAM- CTGACACTAACATGAATCGGCGGACAGC-TAMRA 3′

驢源性分檢測(cè)用引物（對(duì)）序列為：

FP：5′- CCTCAGCACTCCCCCTCAT -3′

RP：5′- AAGGATAAGGGCTAATACACCA -3′

Pro：5′ FAM- CCAGAATGGTATTTCCTATTTGCTTACGCC-TAMRA3

二、提取馬、驢DNA

引物和探針搞定后，接下來(lái)就是DNA了，為此小新專門在淘寶上購(gòu)買了一份馬肉和一份驢肉，然后用Simgen動(dòng)物組織DNA試劑盒（Cat.No.3101050）分別提取馬肉和驢肉的DNA。

三、PCR擴(kuò)增

最后就是PCR擴(kuò)增測(cè)試了，在配置擴(kuò)增試劑的時(shí)候，小新突然想到網(wǎng)上說(shuō)的驢肉頻繁造假事情，再加上買的驢肉居然比馬肉還便宜，心里有些不踏實(shí)，于是決定驗(yàn)證一番。擴(kuò)增曲線如下：

1-4是用的馬特異性引物探針，1是陰性對(duì)照，2、3是提取的馬肉DNA，4是提取的驢肉DNA

5-8是用的驢特異性引物探針，5是陰性對(duì)照，6、7是提取的驢肉DNA，8是提取的馬肉DNA

購(gòu)買的馬肉看來(lái)是真的，擴(kuò)增結(jié)果無(wú)異常。但是驢肉確實(shí)是假的，這個(gè)所謂的驢肉不能用驢的特異性引物探針擴(kuò)增出來(lái)，但可以用馬的特異性引物探針擴(kuò)增出來(lái)，只能說(shuō)明這是馬肉造假的驢肉。

四、新一輪探索

于是小新又換了一家淘寶店購(gòu)買驢肉，并和店家溝通了一番。在了解到小新是為了做物種檢測(cè)后，商家大方的送了一根帶點(diǎn)肉的驢骨做檢測(cè)用。用骨頭上帶著的驢肉提取了DNA并進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，結(jié)果如下：

1-4是用的馬特異性引物探針，1是陰性對(duì)照，2、3是提取的馬肉DNA，4是新提取的驢肉DNA

5-7是用的驢特異性引物探針，5是陰性對(duì)照，6、7是新提取的驢肉DNA

結(jié)果顯示新提取的驢肉DNA不僅能用驢的特異性引物探針擴(kuò)增出來(lái)，同時(shí)也可以用馬的特異性引物探針擴(kuò)增出來(lái)，不過(guò)擴(kuò)增效率要差一些。

小新與小伙伴們對(duì)于這一結(jié)果經(jīng)過(guò)多番探討，覺(jué)得有兩種可能：

1．懷疑驢肉上沾染到了馬的DNA。于是敲開(kāi)驢骨，提取了3管骨髓的DNA進(jìn)行PCR。擴(kuò)增結(jié)果如下：

1-4是用的馬特異性引物探針，1是陰性對(duì)照，2是提取的馬肉DNA，3、4是提取的驢骨髓DNA

5-8是用的驢特異性引物探針，5是陰性對(duì)照，6、7、8是提取的驢骨髓DNA

結(jié)果顯示驢骨髓DNA仍舊能用馬的引物探針擴(kuò)增出來(lái)，這說(shuō)明不是樣本的問(wèn)題。

2.懷疑馬的引物有問(wèn)題。于是專門去NCBI上Blast，發(fā)現(xiàn)確實(shí)有點(diǎn)問(wèn)題，用馬的引物進(jìn)行Primer-BLAST時(shí)，查找生物選擇驢（Equus asinus），最后居然也找到了對(duì)應(yīng)的序列，當(dāng)然其中有個(gè)別堿基不同，這應(yīng)該就是為什么擴(kuò)增效率低的原因吧。

之后小新又重新合成了一組新的引物探針，這次采用的是《SNT 3730.5-2013 食品及飼料中常見(jiàn)畜類品種的鑒定方法 第5部分：馬成分檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光PCR法》中的引物探針序列，并且上NCBI又核對(duì)了一遍，確認(rèn)沒(méi)有問(wèn)題。最后擴(kuò)增結(jié)果如下：

結(jié)果證實(shí)確實(shí)是引物探針存在問(wèn)題。

五、總結(jié)與分析

1. 馬和驢都是屬于脊索動(dòng)物門、脊椎動(dòng)物亞門、哺乳綱、奇蹄目、馬科、馬屬，只有種不一樣，親緣關(guān)系比較近，導(dǎo)致兩者間的基因有很多相同或者類似的，因此設(shè)計(jì)引物時(shí)需要多加注意。

我們的實(shí)驗(yàn)證明了《SNT 3730.5-2013 食品及飼料中常見(jiàn)畜類品種的鑒定方法 第5部分：馬成分檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光PCR法》中設(shè)計(jì)的馬引物探針序列比較靠譜，《SB/T 10923-2012 肉及肉制品中豬、牛、羊、馬、驢、雞、鴨、鵝、兔源性成分的快速鑒定 實(shí)時(shí)PCR法》中的馬引物探針設(shè)計(jì)有缺陷，建議不要采用。

2. 造假情況比我們想象的還要接近我們的生活，就像這次買的“驢肉”，當(dāng)時(shí)還是挑選的一家銷量不錯(cuò)的店，沒(méi)想到還是被騙了。由于賣家對(duì)我們這種專業(yè)做物種源性檢測(cè)的用戶還拒不認(rèn)錯(cuò)，我們決定曝光一下這家淘寶天貓店——味健旺旗艦店，提醒大家不要上當(dāng)受騙。

3. 這次實(shí)驗(yàn)可謂是一波三折，不僅買的樣品出現(xiàn)造假情況，就連非常嚴(yán)肅的參考資料都有漏洞。這就提醒我們不能盲目相信網(wǎng)上的各種信息，科學(xué)地設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，細(xì)心地驗(yàn)證，才是最有保障的獲取知識(shí)的方法。

備注：實(shí)驗(yàn)所采用的一些儀器、設(shè)備、試劑如下

試劑：

動(dòng)物組織DNA試劑盒（Simgen，Cat.No.3101050）

2×Probe qPCR Mix（Simgen，Cat.No.7206100）

儀器：

超微量電子天平（DENVER INSTRUMENT，TP-213）

旋渦震蕩器（越新儀器，XH-C）

臺(tái)式離心機(jī)（eppendorf Centrifuge 5415 D）

超微量分光光度計(jì)（Simgen Cat.No.sim100）

熒光定量PCR儀（ABI7500）