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受新冠疫情的影響，病毒樣本保存液的市場需求量突然劇增，市面上也相繼出現(xiàn)了一批批病毒保存液。但是這些保存液良莠不齊，有的不能室溫保存，增加了保存和運(yùn)輸成本；有的沒有滅活病毒作用，增加了檢測人員的感染風(fēng)險(xiǎn)；有的甚至保存效果不佳，嚴(yán)重影響了后續(xù)檢測靈敏度。現(xiàn)階段的樣本采集大多還是采用拭子采樣，但是這種侵入性的樣本采集方法頗為“痛苦”，特別不適合兒童或者嬰幼兒的采樣。因此國外最近開始大量使用唾液采樣代替拭子采樣來進(jìn)行新冠病毒檢測了，并且該方法已被證明與當(dāng)前的拭子采樣具有同等的敏感性和特異性。
前段時(shí)間就有客戶詢問能否用我們的RNA樣本保存液保存唾液中的病毒樣本。但是考慮到RNA樣本保存液通常用于組織樣本，對(duì)于唾液樣本的保存可能不太理想，因此我們專門研發(fā)了一款適用于液體樣本中病毒RNA保存的新產(chǎn)品——病毒樣本保存液。下面讓我們對(duì)比一下新研發(fā)的病毒樣本保存液和RNA樣本保存液在唾液樣本中病毒RNA保存方面的效果差異。
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/span>
對(duì)比病毒樣本保存液和RNA樣本保存液對(duì)唾液樣本中病毒RNA的保存效果差異。
二、實(shí)驗(yàn)材料：
1. 病毒樣本保存液（Simgen Cat.No.4112100）
2. RNA樣本保存液（Simgen Cat.No.4007020）
3. Carrier RNA（Simgen Cat.No.4003101）
4. 新鮮采集的唾液
5. 電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，DNP-9082）
6. 旋渦震蕩器（越新儀器，XH-C）
7. 臺(tái)式離心機(jī)（eppendorf Centrifuge 5415 D）
8. 超微量分光光度計(jì)（Simgen Cat.No.sim100）
9. 電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-6C型）
三、實(shí)驗(yàn)方法：
用添加了Carrier RNA的唾液與保存液按比例混合，放入37℃恒溫箱中，每隔一周提取一次RNA，觀察保存液的保存效果。
RNA樣本保存液：唾液=3:1 | 病毒樣本保存液 ：唾液=2：1 |
1. 將混合液上下翻轉(zhuǎn)混合均勻，吸取100 μl混合液到RNase-free的1.5 ml離心管中，加入300 μl裂解液，旋渦振蕩數(shù)秒混合均勻，室溫靜置10分鐘； 2. 加入320 μl無水乙醇，溫和地翻轉(zhuǎn)離心管3~5次混合均勻； 3. 稍離，吸取液體到核酸純化柱中，13000 rpm離心30秒，棄濾液； 4. 在核酸純化柱中加入600 μl Buffer WA，離心棄濾液； 5. 在核酸純化柱中加入700 μl Buffer WBR，離心棄濾液； 6. 14000 rpm離心1分鐘去除殘留液體； 7. 將核酸純化柱置于一個(gè)RNase-free的1.5 ml離心管中，加入50 μl RNase Free Water，室溫靜置1分鐘，離心洗脫得到RNA。 | 1. 將混合液上下翻轉(zhuǎn)混合均勻，吸取300 μl混合液到RNase-free的1.5 ml離心管中，13000 rpm離心2 min； 2. 吸取上清到新的1.5 ml離心管中，加入300 μl 70%乙醇，溫和地翻轉(zhuǎn)離心管3~5次混合均勻； 3. 稍離，吸取液體到核酸純化柱中，13000 rpm離心30秒，棄濾液； 4. 在核酸純化柱中加入600 μl Buffer WA，離心棄濾液； 5. 在核酸純化柱中加入700 μl Buffer WBR，離心棄濾液； 6. 14000 rpm離心1分鐘去除殘留液體； 7. 將核酸純化柱置于一個(gè)RNase-free的1.5 ml離心管中，加入200 μl RNase Free Water，室溫靜置1分鐘，離心洗脫得到RNA。 |
8. 將提取到的RNA在超微量分光光度計(jì)上測量濃度，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠RNA電泳檢測。 | |
四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
1. 在超微量分光光度計(jì)上用RNase Free Water調(diào)零，測量洗脫下來的RNA，結(jié)果如下：
37℃保存1周后的結(jié)果：
37℃保存2周后的結(jié)果：
1、2是RNA樣本保存液保存的唾液樣本提取的RNA；
3、4是病毒樣本保存液保存的唾液樣本提取的RNA。
2. 在1%的瓊脂糖凝膠上，加入8 μl提取到的RNA，電泳25分鐘左右，結(jié)果如下：
五、討論與分析：
1. 從操作步驟分析，用RNA樣本保存液保存的樣本后續(xù)提取操作稍顯復(fù)雜，需要用到裂解液，且起始樣本量低，一次提取能夠得到的RNA量較少；而用病毒樣本保存液保存的樣本后續(xù)提取更加方便，無需裂解液，且起始樣本量大，一次提取使用的唾液樣本量相當(dāng)于用RNA樣本保存液保存的唾液樣本的4倍，這對(duì)后續(xù)檢測來說相當(dāng)于提高了檢測靈敏度。
2. 因?yàn)椴《?/span>樣本保存液起始唾液樣本的用量相當(dāng)于RNA樣本保存液的4倍，因此為了方便比較，將病毒樣本保存液提取的樣本的洗脫體積增加到200 μl。從濃度測量結(jié)果顯示，用病毒樣本保存液保存的樣本提取的濃度更高，且隨著37℃放置時(shí)間的增加，濃度數(shù)值減少的趨勢明顯小于RNA樣本保存液保存的樣本，說明病毒樣本保存液保存唾液中RNA的效果比RNA樣本保存液更穩(wěn)定。
3. 從電泳圖分析，用病毒樣本保存液保存的樣本提取到的Carrier RNA條帶明顯比RNA樣本保存液保存的樣本提取到的條帶要亮，這與測得的濃度有很好的對(duì)應(yīng)關(guān)系。兩種保存液提取的Carrier RNA隨著在37℃放置時(shí)間的增加，降解情況變化不大，說明兩種保存液均能在室溫環(huán)境（≤37℃）下保護(hù)RNA不被水解。
綜上，兩種保存液均能室溫保存唾液樣本中的RNA，且在2周內(nèi)沒有明顯差異。相比較而言病毒樣本保存液能提取的起始樣本更多，如果用于新冠病毒RNA的核酸檢測靈敏度應(yīng)該更高。當(dāng)然這只是用Carrier RNA測試的結(jié)果，如果用RNA病毒測試又會(huì)有什么樣的結(jié)果呢，敬請期待下期實(shí)驗(yàn)結(jié)果。