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眾所周知，RNA非常脆弱，因為環(huán)境中到處都有它的天敵——RNA酶，一不小心RNA就被降解了。而RNase Inhibitor的出現(xiàn)很好地解決了這一問題，它能與RNA酶結(jié)合，抑制RNA酶的活性，從而保護RNA，因此在很多RT-PCR實驗中，添加RNase Inhibitor是必須的，那么如何判斷RNase Inhibitor的性能效果呢？今天我們就給大家介紹兩種RNase Inhibitor性能檢測方法。
一、實驗目的：
用不同方法對RNase Inhibitor性能效果進行檢測。
二、實驗材料：
1. 檢測RNase Inhibitor（兩種方法檢測的不是同一批次）和對照RNase Inhibitor（40 U/μl）
2. RNase A：50 mg/ml（Simgen Cat.No.8001001）
3. RNA樣本：大鼠肌肉組織RNA、Carrier RNA
4. Rat β-acting引物（Forward：CCCATCTATGAGGGTTACGC/Reverse：TTTAATGTCACGCACGATTTC）
5. cDNA第一鏈合成試劑盒（Simgen Cat.No.7306025）、2×SYBR Green PCR Mix（Simgen Cat.No.7106100）
6. 熒光PCR儀（ABI 7000）
7. PCR儀（Techne FPROGO5Y Progene Thermal）
8. 臺式離心機（eppendorf Centrifuge 5415 D）
9. 電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-6C型 ）
三、實驗方法與結(jié)果：
方法一：熒光PCR法
1. 將RNase A梯度稀釋至5 ng/μl；
2. 將cDNA第一鏈合成試劑盒中的試劑、大鼠RNA（317 ng/μl）、2×SYBR Green PCR Mix、引物在室溫（15-25℃）解凍，解凍后迅速置于冰上。使用前將每種溶液混勻，簡短離心。
3. 按照表1的基因組DNA去除體系配制混合液，徹底混勻。簡短離心，并置于37℃，孵育30 min，以保證RNase A有充分時間去降解RNA。然后置于42℃，孵育3 min，置于冰上放置。
編號 試劑 | 陰性對照 | 對照組 | 檢測組 | 空白對照 | ||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | |
5×gDNA Buffer（μl） | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
RNA（μl） | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
RNase A（ng） | 1.6 | 1.6 | 1.6 | 1.6 | 1.6 | 1.6 | -- | -- |
RNase Inhibitor（μl） | -- | -- | 1 | 1 | 1 | 1 | -- | -- |
RNA-Free H2O（μl） | 補足到10μl | |||||||
注：為避免RNA與RNase A接觸提前發(fā)生降解，預先將RNase Inhibitor與RNase A按比例混合后再加入體系。
4、按照表2的反轉(zhuǎn)錄反應體系配制混合液。
5× RT Buffer | 4μl |
RT Enzyme Mix | 2μl |
RT Primer Mix | 4μl |
表2 反轉(zhuǎn)錄反應體系
5、將反轉(zhuǎn)錄反應體系中的混合液，加到gDNA去除反應體系的混合液中，充分混勻，簡短離心以收集殘留在管壁的液體。
6、42℃，孵育15 min。
7、95℃，孵育3 min之后放于冰上。
8、用2×SYBR Green PCR Mix、Rat β-acting引物配置反應液，取5 μl cDNA進行熒光PCR檢測。
根據(jù)擴增結(jié)果可知，陰性對照組（1、2）CT值為25.78和25.04，平均值為25.41，對照組（3、4）CT值為20.03和19.84，平均值為19.935，檢測組（5、6）CT值為21.70和21.34，平均值為21.52，空白對照組（7、8）CT值為19.28和19.56，平均值為19.42。由此得出結(jié)論，陰性對照組CT值比空白對照組CT值大，說明其中的RNA有部分被RNase A降解了；而檢測組CT值比陰性對照組CT值小，比對照組CT值大，說明檢測組的RNase Inhibitor確實起到了抑制RNase A的作用，但效果沒有對照組好。實驗結(jié)果：
方法二：電泳法
1. 將RNase A（50 mg/ml）稀釋至10 ng/ul、1 ng/ul、0.1 ng/ul、0.01 ng/ul，按下表配置反應體系，兩組檢測組（檢測RNase Inhibitor和對照RNase Inhibitor），一組陰性對照（不加RNase Inhibitor）以及一組空白對照組，平行做兩管。
檢測組 | Rnase A （10 ng/ul） | Rnase A （1 ng/ul） | Rnase A （0.1 ng/ul） | Rnase A （0.01 ng/ul） |
5xRT Buffer | 4μl | 4μl | 4μl | 4μl |
RNase Inhibitor | 1μl | 1μl | 1μl | 1μl |
Rnase A | 2μl | 2μl | 2μl | 2μl |
RNA（500 ng/μl） | 1μl | 1μl | 1μl | 1μl |
RNase-free Water | 12μl | 12μl | 12μl | 12μl |
陰性對照 | Rnase A （10 ng/ul） | Rnase A （1 ng/ul） | Rnase A （0.1 ng/ul） | Rnase A （0.01 ng/ul） |
5xRT Buffer | 4μl | 4μl | 4μl | 4μl |
RNase Inhibitor | - | - | - | - |
Rnase A | 2μl | 2μl | 2μl | 2μl |
RNA（500 ng/μl） | 1μl | 1μl | 1μl | 1μl |
RNase-free Water | 13μl | 13μl | 13μl | 13μl |
空白對照組 |
|
RNA（500 ng/μl） | 1μl |
RNase-free Water | 19μl |
3. 取5 ul混液+1 ul 6×Loading Buffer，進行瓊脂糖凝膠電泳。
四、實驗結(jié)果：
從電泳結(jié)果分析，加了RNA酶的樣本，隨著RNase A濃度的減少，降解更慢，從降解情況看，對照組RNase Inhibitor和檢測組RNase Inhibitor效果差不多。
五、討論與分析：
1. 兩種方法都可以對RNase Inhibitor的效果性能進行一種有效的檢測。熒光法比較直觀，可以準確的通過CT值大小得出結(jié)論；電泳法相對而言實驗結(jié)果沒有熒光PCR法準確，只能簡單通過肉眼判斷差異，但是勝在操作更加簡單、方便快捷。
2. 如果想要精確判斷檢測的RNase Inhibitor具體活力濃度，推薦使用熒光PCR法；如果只想粗略判斷RNase Inhibitor效果，則可以使用電泳法。