最近實(shí)驗(yàn)室接到一個(gè)客戶的投訴，說(shuō)是購(gòu)買的DL2000 DNA Ladder有問(wèn)題，跑電泳時(shí)出現(xiàn)DNA降解的情況。由于Simgen的DNA Marker含有DNA穩(wěn)定劑，曾經(jīng)在室溫條件下做過(guò)放置一年的真實(shí)穩(wěn)定性測(cè)試，都未觀察到DNA降解的現(xiàn)象，所以對(duì)于客戶的投訴感到非常疑惑。但是為了慎重起見(jiàn)，我們還是從庫(kù)存產(chǎn)品中抽了一支相同批次的DL2000 DNA Ladder進(jìn)行了電泳實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示條帶正常，并未出現(xiàn)降解情況。

既然不是產(chǎn)品本身的問(wèn)題，那么就有可能是電泳過(guò)程中出現(xiàn)的問(wèn)題。Simgen實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)探索，最后我們猜測(cè)可能已經(jīng)找到了問(wèn)題的癥結(jié)所在，結(jié)合之前有一篇詳細(xì)介紹如何制作一張漂亮的瓊脂糖凝膠電泳圖的文章，今天再給大家介紹一個(gè)非常容易被忽略的因素——核酸染料的用量。

一、實(shí)驗(yàn)材料：

DL2000 DNA Ladder（Simgen Cat.No.MD1006）

瓊脂糖（BIOWEST REGULAR AGAROSE G-10）

50×TAE（Simgen Cat.No.9001500）

溴化乙錠（EB）（Simgen Cat.No.9026001）

電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-6C型 ）

二、實(shí)驗(yàn)步驟：

1. 取10 ml 50×TAE，加入490 ml去離子水，混合均勻，稀釋成1×TAE。

2. 用瓊脂糖，1×TAE制作兩塊相同濃度（1%）的凝膠，一塊加入正常用量的溴化乙錠（終濃度0.5 μg/ml），一塊加入過(guò)量的溴化乙錠（終濃度3 μg/ml）。

3. 分別在兩塊凝膠中依次加入1.5 μl、5 μl、10 μl DL2000 DNA Ladder，放入同一電泳槽進(jìn)行電泳。

4. 每隔一段時(shí)間取出凝膠，觀察并記錄條帶情況。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

    電泳圖如下，圖一電泳了10分鐘，圖二電泳了15分鐘，圖三電泳了20分鐘，圖四是電泳25分鐘的條帶情況，每張圖的左側(cè)部分是正常溴化乙錠用量的凝膠，右側(cè)部分是過(guò)量溴化乙錠用量的凝膠。

1. 從圖一來(lái)看，兩塊凝膠跑出來(lái)的條帶情況差不多，都很模糊，這是因?yàn)殡娪緯r(shí)間太短，條帶沒(méi)能完全分開(kāi)，擠成一團(tuán)顯得很糊，這再次驗(yàn)證了電泳時(shí)間的重要性。

2. 圖二顯示，左側(cè)條帶開(kāi)始有分散開(kāi)的趨勢(shì)，而右側(cè)條帶除了最上方的那條，其余條帶仍舊擠成一團(tuán)，模糊不清。

3. 從圖三、圖四可以看出，左側(cè)的DL2000 DNA Ladder條帶均已分開(kāi)，帶型清晰，而右側(cè)的DL2000 DNA Ladder下方條帶仍舊十分模糊，類似拖尾的狀態(tài)，和降解情況很是相像。仔細(xì)看的話，還能夠發(fā)現(xiàn)加的DNA量越多，條帶越糊。

4.仔細(xì)對(duì)比圖一到圖五，可以發(fā)現(xiàn)，客戶投訴說(shuō)Marker有降解情況的條帶（圖五）與圖一和圖二中溴化乙錠過(guò)量導(dǎo)致的條帶情況很是類似，均是最上面的條帶分開(kāi)了，下面的其他條帶擠在一起，模糊不清。

四、討論與分析

1. 我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了：溴化乙錠用量過(guò)多會(huì)導(dǎo)致電泳的條帶變模糊，出現(xiàn)類似拖尾的情況。

2. 關(guān)于溴化乙錠會(huì)影響DNA條帶的泳動(dòng)速度，早有前輩們已經(jīng)提到過(guò)了——有一種精確標(biāo)定DNA分子量的電泳方法是這樣要求的：制作一塊不含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠，電泳結(jié)束后再將凝膠放入含溴化乙錠（0.5 μg/ml）的電泳緩沖液中浸泡30—45分鐘，待溴化乙錠分子嵌入DNA分子后再在紫外燈下觀察。（分子克隆實(shí)驗(yàn)指南 精編版P.158）

3. 從深層次分析原因，我們猜測(cè)可能性如下：核酸是帶負(fù)電的，而溴化乙錠中能嵌入DNA雙鏈中的基團(tuán)是帶正電的（溴離子不參與染色），電泳過(guò)程中兩者的運(yùn)動(dòng)方向剛好相反，當(dāng)溴化乙錠量過(guò)多的情況下，對(duì)核酸的反向作用力就顯現(xiàn)出來(lái)了：通過(guò)給核酸向正極的泳動(dòng)施加一個(gè)阻力，使得核酸的移動(dòng)變得困難，相同長(zhǎng)度的條帶的核酸泳動(dòng)速度變得混亂，最終使整個(gè)條帶因此變寬了，如果多個(gè)條帶黏連在一起就形成了類似降解的現(xiàn)象。這種現(xiàn)象隨著核酸上樣量的增加，會(huì)變得越發(fā)明顯。

因此，溴化乙錠等類似的核酸染料使用過(guò)程中一定要控制好用量（注意Gelred或者Gelgreen核酸染料更要注意控制用量，因?yàn)?/span>Gelred是由兩個(gè)溴化乙錠分子拼接起來(lái)，而Gelgreen則是由兩個(gè)SYBR Green分子拼接起來(lái)的，顯色靈敏度或許更高了，但嵌入核酸分子中后的阻力也更大了），按說(shuō)明書上的標(biāo)準(zhǔn)用量使用，切忌太過(guò)隨意。