因為新冠疫情，越來越多的核酸診斷試劑廠家了解到Carrier RNA的重要性——它能夠在病毒核酸提取的過程中，提高病毒核酸的回收效率，減少RNA被RNA酶降解的幾率，大大提高了后續(xù)檢測的靈敏度，是痕量核酸提取中必不可少的重要組分。

既然Carrier RNA作用這么大，是不是用的越多越好呢？我們了解下一些知名品牌的試劑盒中Carrier RNA的用量，QIAGEN的QIAamp MinElute Virus Spin Kit和TIANGEN的病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒每次提取Carrier RNA的用量均為5.6 μg，TaKaRa的MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit每次提取Carrier RNA的用量為6 μg。幾家公司每次樣本使用的Carrier RNA都在5~6 μg之間，但是如果每次加入更多的Carrier RNA，效果會更好嗎？

一、 實驗目的

測試增大Carrier RNA用量對病毒核酸檢測靈敏度的影響。

二、 實驗儀器及試劑

儀器：

熒光定量PCR儀（ABI PRISM® 7500 Sequence DeteCtion System）

臺式小量離心機（eppendorf Centrifuge 5415 D）

迷你金屬水浴鍋（杭州米歐儀器）

旋渦震蕩器（越新儀器，XH-C）

試劑：

人血漿

新冠假病毒（10⁸ copies/ml）

豬DNA溶液 （100 ng/μl）

病毒核酸純化試劑盒（Simgen,Cat.NO.4002050）

2×One Step Probe RT-PCR Mix（Simgen,Cat.NO.7406100）

新冠病毒引物及探針（F:CCCTGTGGGTTTTACACTTAA/R:ACGATTGTGCATCAGCTGA，Probe:5′FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1′3）

2×Probe qPCR Mix（Simgen,Cat.NO.7206100）

豬特異性引物及探針（F:CGACAAAGCAACCCTCACAC/R:TGCGAGGGCGGTAATGAT，Probe:5′FAM-CTTCGCCTTCCACTTTATCCTGCCATTC-BHQ1-3′）

三、 實驗步驟與結果分析

（一）用新冠假病毒代替RNA病毒測試

1. 用血漿將假病毒稀釋至10⁶ copies/ml。

2. 向Buffer VL中加入Carrier RNA，每500μl的Buffer VL中分別加入5μl、10μl和15μl 濃度為2.5μg/μl的Carrier RNA（相當于每次提取用了5 μg、10 μg、15 μg的Carrier RNA）。

3. 取6個1.5ml離心管，分別加入20 μl 蛋白酶K 貯存液，再加入200 μl血漿。

4. 每管加入200 μl含Carrier RNA的Buffer VL（每種用量各做兩管測試） ，旋渦振蕩約15 秒混勻。

5. 56℃水浴10 分鐘。

6. 加入320 μl無水乙醇，溫和地翻轉4~6 次混合均勻 。

7. 將溶液轉移到核酸純化柱中離心去濾液；

8. 加入700 μl Buffer WBR，離心去濾液；

9. 14000rpm空離1分鐘去除殘留液體；

10. 棄 2 ml 離心管，將核酸純化柱置于一個潔凈的 1.5 ml 離心管中，在純化柱膜中央加入50 μl 56℃預熱的 Buffer TE ，蓋上管蓋，室溫靜置1分鐘，離心得到假病毒RNA；

11. 用2×One Step Probe RT-PCR Mix、新冠病毒引物及探針配置反應液，用洗脫的5 μl假病毒RNA為模板進行熒光PCR。

熒光PCR擴增曲線及CT值如下：

從CT值可知，Carrier RNA的用量增加到10 μg、15 μg時，與5 μg Carrier RNA用量的曲線對比，后續(xù)RT-PCR反應增大了3~4個CT值，并且15 μg和10 μg Carrier RNA用量的兩個條件之間的CT值差異不是很大。說明在RNA病毒的檢測中，提高Carrier RNA的用量不僅沒有提高檢測靈敏度，反而降低了檢測的靈敏度。

（二）用豬DNA代替DNA病毒測試

用血漿將豬DNA稀釋10³倍，用病毒核酸純化試劑盒提取DNA，方法步驟和上文提取新冠假病毒一樣，最后用2×Probe qPCR Mix對豬DNA進行熒光PCR擴增。

擴增曲線及CT值如下：

從CT值可知，Carrier RNA的用量增加到10 μg、15 μg時，后續(xù)PCR反應的CT值確實變小了一些，但是變化幅度很小，甚至不排除這種減少是孔間差異所造成的。因此提高Carrier RNA的用量對后續(xù)病毒DNA的檢測靈敏度幾乎沒有影響。

四、 分析與討論

1. 從新冠假病毒測試結果可以得出結論，同一個樣本用于RNA病毒檢測時，如果Carrier RNA的每次用量超過5 μg的，后續(xù)RT-PCR反應的CT值會變大，反而降低了檢測靈敏度。

2. 從豬DNA的測試結果可以得出結論，同一個樣本用于DNA病毒檢測時， Carrier RNA的用量加大后，CT值變化不明顯，對后續(xù)檢測靈敏度的影響不大。

3. Carrier RNA能提高痕量核酸的回收效率這一點我們是很明確的，理論上增大Carrier RNA不會降低病毒RNA的回收效率，為什么后續(xù)RT-PCR的CT值會減小（CT值增大也可以解讀為回收到的核酸中病毒RNA減少）呢？在模擬病毒DNA回收的實驗中，加大Carrier RNA并未觀察到CT值減小的結果，可以推斷出在病毒RNA回收實驗中，提高Carrier RNA的用量也不會減少病毒RNA的回收效率。所以我們猜測最大的可能性是源自于病毒RNA在逆轉錄步驟中受到了干擾，過量的Carrier RNA干擾了逆轉錄酶的工作效率，所以現(xiàn)象出來的結果就是CT值變大了。

Carrier RNA雖然對痕量核酸提取的幫助非常大，但看來也不是加得越多越好的，加多了成本肯定會增加，而且用于DNA病毒檢測靈敏度沒有多少提升，用于RNA病毒檢測反而出現(xiàn)降低檢測靈敏度的情況。所以面對DNA樣本還是RNA樣本的核酸提取，大家在決定實驗中Carrier RNA的使用量時要區(qū)別對待，特別是RNA樣本，必須要考慮回收到的RNA中的Carrier RNA對后續(xù)RT-PCR體系的影響。也就是說，Carrier  RNA的最佳用量除了參考市場上商品化試劑盒的使用量外，還應該要根據后續(xù)配套的RT-PCR體系一起驗證才能最終確定。