前段時間，有個客戶投訴說用快速質粒DNA小量試劑盒提取的質粒DNA濃度低，詢問他細菌用量的時候，客戶說出一個令人震驚的用量——20 ml，明明試劑盒說明書中標明的用量是1-5 ml，為什么要使用那么多的細菌呢？客戶回復說師兄師姐都是這么做的，她也就這么做了，而且之前師兄師姐做也沒出問題。為了探究加大菌液用量會有什么影響，小新專門進行了以下測試。

一、實驗目的：

測試用快速質粒DNA小量試劑盒分別提取5 ml、10 ml、15 ml和20 ml細菌時的效果。

二、實驗儀器及試劑：

儀器：旋渦震蕩器（越新儀器，XH-C）

臺式離心機（eppendorf Centrifuge 5415 D）

超微量分光光度計（Simgen Cat.No.sim100）

電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-6C型）

試劑：快速質粒DNA小量試劑盒（Simgen,Cat.NO.1005050）

三、實驗方法：

考慮到接種量、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基體積的不同，最終細菌濃度也會有差別，因此本次實驗進行了兩次測試，分別測試低濃度和高濃度的細菌。具體操作如下：

1. 用50 ml離心管分別收集過夜培養(yǎng)的細菌5 ml，10 ml，15 ml，20 ml各兩管，棄盡培養(yǎng)基。加入250 μl已加入RNase A 的Buffer I，充分懸浮沉淀的細菌。

2. 把懸浮液轉移到1.5 ml離心管，加入250 μl Buffer II，溫和并充分地翻轉離心管4-6次。

3. 加入350 μl Buffer N8，溫和并充分地翻轉離心管直至溶液中殘留的藍色沉淀全部消失，轉變?yōu)榈S色沉淀。

4. 最高速（≧12000 rpm）離心2分鐘。

5. 將核酸純化柱置于2 ml離心管中，將步驟4中的上清液倒入核酸純化柱中，蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。

6. 棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，在核酸純化柱中加入800 μl Buffer W2，蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。

7. 棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，最高速 （≧12000 rpm）離心1分鐘。

8. 棄2 ml離心管，將核酸純化柱置于一個潔凈的1.5 ml離心管中，在純化柱的膜中央加入100 μl Buffer E，蓋上管蓋，室溫靜置1分鐘，12000 rpm離心30秒。

9. 棄純化柱，得到質粒DNA。 

四、實驗結果：

1. 在超微量分光光度計上用Buffer E調零，取2 μl洗脫的質粒DNA檢測，記錄各個波長的吸光度，得到的數(shù)據(jù)如下：

 2. 在1%瓊脂糖凝膠上，取5 μl質粒DNA進行電泳，結果如下：

3. 加入Buffer N8充分中和并離心后的現(xiàn)象如下圖：在1%瓊脂糖凝膠上，取5 μl質粒DNA進行電泳，結果如下：

五、分析與討論：

1. 結合表一和圖一分析可知，當細菌濃度較低時，細菌用量在5 ml、10 ml、15 ml時，隨著細菌用量的增加，提取的質粒DNA確實增加了，同時殘留的RNA也相應的增加了。但是當細菌用量到達20 ml時，提取的質粒DNA反而比15 ml時要少。說明細菌濃度較低時，增加細菌用量，能相應獲得更多的質粒DNA，但是細菌用量超出一定范圍后，質粒DNA的提取效率反而降低。

2. 結合表二和圖二分析可知，不管是10 ml細菌，還是15 ml、20 ml細菌，提取到的質粒DNA均沒有5 ml細菌多（注意：雖然從分光光度計上測得10 ml細菌提取到的質粒DNA濃度較5 ml細菌的更高，但是電泳并沒有顯示出更高的DNA濃度，所以應該是殘留的RNA對數(shù)據(jù)造成了干擾）。說明細菌濃度較高時，超出5 ml的細菌用量就會降低最終的質粒DNA的提取效率了。

3. 其實只要我們稍微認真思考一下就會明白，關鍵因素是每次提取質粒DNA時細菌菌體的用量，而非細菌培養(yǎng)物的體積——因為不同的宿主菌、不同的培養(yǎng)基以及不同的細菌培養(yǎng)條件下每ml細菌培養(yǎng)物中的細菌數(shù)量會有很大的差異。那么問題來了，我們怎么確定自己是否使用了合適的細菌用量呢？首先，我們先要認真遵循說明書建議的細菌用量提取質粒DNA，操作至加入Buffer N8中和后離心2分鐘，接著仔細觀察沉淀的菌體碎片的沉積效果：如果菌體碎片沉積在底部形成一團致密的小塊，比如圖三的10 ml 和15 ml，以及圖四的5 ml，都是比較合適的細菌用量；圖三的5 ml中部分菌體碎片沉淀物貼在了管壁上，這是菌體用量過少的特征，可以適當增加菌體的用量。圖三中的20 ml（右側的那一管），圖四中的10 ml、15 ml和20 ml，產(chǎn)生的菌體碎片沉淀蓬松，不致密，這都是菌體使用量過多的特征，必須減少菌體的用量。

4. 現(xiàn)在我們大致可以推測出為什么用戶會用20 ml細菌提取質粒DNA了，或許她的師兄師姐養(yǎng)的細菌濃度較低，探索出增加細菌用量可以提高最后質粒DNA的濃度，于是就把這一方法教給了她，然而碰巧她用20 ml高濃度的細菌提取質粒DNA時，問題就產(chǎn)生了。事實上，后續(xù)用戶聽從我們的建議用5 ml菌液提取質粒DNA后，所投訴的問題也就迎刃而解了。

5. 如果從更深層次去分析原因，其本質上是細菌使用量過多時，溶解細菌的效率降低，不能被充分溶解破裂的細菌就不能充分釋放質粒DNA，在中和步驟時大部分的質粒DNA仍然被包裹在菌體碎片、變性蛋白及基因組DNA所形成的沉淀物中，導致了質粒DNA回收效率過低。   

本次實驗說明了一點，在質粒DNA提取的過程中，用多少ml菌液提取質粒DNA確實是可變的，但是一味想著用提高菌液用量的方法來提高質粒DNA的濃度卻會適得其反。當然只要我們培養(yǎng)的細菌每ml所含的質粒數(shù)量較多，我們就沒必要老琢磨著用提高菌液用量的方法去獲取更多的質粒DNA了，所以我們再引用一遍說明書中關于細菌培養(yǎng)的關鍵內容，希望同學們牢記于心：

(1) 不應吸取儲存的甘油菌直接進行培養(yǎng)。長時間儲存的甘油菌中的細菌可能已經(jīng)出現(xiàn)細菌個體間基因型的變化，并混有丟失質粒的細菌。甘油菌必須在含有抗生素的平板上劃線篩選，挑選生長良好的單菌落用于接種培養(yǎng)。

(2) 不要挑取多個單克隆菌落到一份液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。不同單克隆菌落間可能由于存在基因型差異的原因，相互間有生存競爭關系，反而使收獲的菌量減少。

(3) 2-8℃冰箱中存放超過2周的平板中的菌落已經(jīng)開始死亡，不再適合接種培養(yǎng)。

(4) 細菌培養(yǎng)時間不應超過16小時。培養(yǎng)時間超過16小時的細菌開始出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，可能因此導致質粒DNA的得率降低。

(5) 用于細菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基所占容器的體積不應大于1/4。