一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

測(cè)試不同病毒核酸樣本保存液保存病毒RNA的效果。

二、實(shí)驗(yàn)材料

1. 病毒核酸樣本保存液（Simgen Cat.No.4112100）

2. 市場(chǎng)上常見(jiàn)的含胍鹽的病毒核酸樣本保存液（新景生物研發(fā)）

3. 外購(gòu)對(duì)照病毒核酸樣本保存液（取自華越核酸檢測(cè)采樣管，揚(yáng)州華越科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)，蘇揚(yáng)械備20150248號(hào)）

4. 生理鹽水（Simgen Cat.No.9005500）

5. 新冠假病毒（10⁸ copies/ml）（訂單編號(hào)：F1518870，復(fù)百澳（蘇州）生物科技有限公司）

6. 新鮮采集的人唾液

7. 病毒核酸純化試劑盒（Simgen Cat.No. 4002050）（產(chǎn)品批號(hào)：20211203）

8. 2×One Step Probe RT-PCR Mix（Simgen Cat.No.7406100）（產(chǎn)品批號(hào)：20211240）

9. 新冠病毒特異性引物及探針（F：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA/R：ACGATTGTGCATCAGCTGA，Probe：5’-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3’）

10. 電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，DNP-9082）

11. 旋渦振蕩器（越新儀器，XH-C）

12. 臺(tái)式離心機(jī)（eppendorf Centrifuge 5415 D）

13. 熒光PCR儀（ABI 7500）

三、實(shí)驗(yàn)方法

1. 用唾液將假病毒（10⁸ copies/ml）稀釋到10⁶ copies/ml；

2. 將三種病毒核酸樣本保存液及生理鹽水與唾液（含假病毒）按5:1的體積比（1.5ml + 0.3 ml）混合均勻，分別放在37℃和﹣80℃保存；

3. 保存第3天和保存第7天用病毒核酸純化試劑盒提取四種保存液保存的假病毒RNA，提取方法如下：

1) 在1.5 ml離心管中加入20 μl蛋白酶K貯存液，再加入200 μl樣本（保存液與唾液樣本的混合物）。

2) 加入200 μl含Carrier RNA的Buffer VL，旋渦振蕩約15秒混勻。

3) 將離心管置于56℃水浴10分鐘。

4) 加入320 μl無(wú)水乙醇，溫和地翻轉(zhuǎn)4~6次混合均勻。

5) 吸取步驟4）中的溶液加入到核酸純化柱中（核酸純化柱置于2 ml離心管中），蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。

6) 棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，在核酸純化柱中加入700 μl Buffer WBR，蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。

7) 棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，13200 rpm離心2分鐘。

8) 棄2 ml離心管，將核酸純化柱置于一個(gè)潔凈的1.5 ml離心管中，在純化柱的膜中央加入50 μl 56℃預(yù)熱的Buffer TE，蓋上管蓋，室溫靜置1分鐘，12000 rpm離心30秒得到病毒RNA。

用2×One Step Probe RT-PCR Mix擴(kuò)增提取到的病毒RNA，擴(kuò)增體系如下

實(shí)驗(yàn)參數(shù)：50℃ 5 min；95℃ 1 min；（95℃ 10s；60℃ 30s）×40 cycles

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1：第3天擴(kuò)增曲線圖

表1：第3天擴(kuò)增結(jié)果CT值

圖2：第7天擴(kuò)增曲線圖

表2：第7天擴(kuò)增結(jié)果CT值

五、分析與討論

1. 根據(jù)擴(kuò)增曲線圖1、圖2及CT值（表1、表2）分析，除了生理鹽水外，其余三種保存液在第三天與第七天時(shí)37℃保存和﹣80℃保存結(jié)果相似，CT值差異較小。

2. 根據(jù)擴(kuò)增曲線圖1、圖2及CT值（表1、表2）分析，37℃存放7天后，新景病毒核酸樣本保存液（平均CT值25.32）對(duì)比含胍鹽的保存液（平均CT值26.10）平均小約0.78個(gè)CT值；比生理鹽水（平均CT值27.45）平均小2.13個(gè)CT值；對(duì)比外購(gòu)的華越科技的病毒核酸樣本保存液（平均CT值35.18）平均小9.86個(gè)CT值。
綜上可以推測(cè)出，與新景病毒核酸樣本保存液保存的新冠假病毒對(duì)比，生理鹽水保存的新冠假病毒在37℃存放7天后約有80%的假病毒RNA被水解；華越科技的病毒核酸樣本保存液保存的新冠假病毒在37℃存放7天后則有99.9%以上假病毒RNA已經(jīng)被水解。

3. 根據(jù)圖1及表1還可以推測(cè)出，在新冠假病毒和病毒樣本保存液混合后，如果病毒樣本保存液中不含滅活RNA酶的蛋白變性劑（比如市場(chǎng)上與生理鹽水同類的非滅活型病毒保存液）的，病毒RNA降解非常迅速，在放入﹣80℃凍存前（操作時(shí)間約20分鐘）已經(jīng)大量水解。

4. 根據(jù)表2的數(shù)據(jù)可以得出結(jié)論，新景生物的病毒核酸樣本保存液與假病毒混合后在37℃存放7天的樣本（平均CT值25.32），與同步在﹣80℃保存的樣本（平均CT值24.8）對(duì)比CT值變化不大，較市場(chǎng)上常見(jiàn)的含胍鹽保存液（滅活型）（平均CT值26.10）保存病毒RNA的穩(wěn)定性更高，配套應(yīng)用于RNA病毒檢測(cè)的取樣環(huán)節(jié)能有效提高檢測(cè)的靈敏度。

5. 外購(gòu)的華越科技的病毒核酸樣本保存液較生理鹽水保存病毒的效果更差，并且在與假病毒混合后即開(kāi)始降解病毒RNA，說(shuō)明該病毒核酸樣本保存液含溶解病毒顆粒的試劑組分，但缺少穩(wěn)定RNA的試劑組分，不能用于病毒RNA樣本的保存。