方法一 大腸桿菌質(zhì)粒DNA的大量提取 (堿法)

1．將含有質(zhì)粒的大腸桿菌在LB液體培養(yǎng)基(含適量抗生素)中37℃培養(yǎng)16-20 小時(shí)。   

2．用含抗生素的LB培養(yǎng)基繁殖大腸桿菌37℃，250rpm，震蕩培養(yǎng)16小時(shí)左右。

3．懸浮菌液移至大離心管內(nèi)，每管500ml，4℃下6000rpm離心15分鐘,棄上清。

4．用“1號(hào)溶液”(18ml/管)回溶菌塊(搖床上慢搖10分鐘)，確保菌塊全部回溶。

5．加2ml濃度為10mg/ml的溶菌酶(溶在1號(hào)溶液內(nèi))，室溫下放置10分鐘。

6．加40ml冷的“2號(hào)溶液”混勻，室溫下放置10分鐘(此時(shí)菌液應(yīng)變清)。

7．每管加20ml冷的“3號(hào)溶液”，充分混勻（不再分兩個(gè)液相），在冰內(nèi)放置10分鐘，并搖動(dòng)混合3次，(此時(shí)細(xì)菌的染色質(zhì)應(yīng)沉淀下來)。

8．4℃下9000rpm，離心15分鐘。如染色體DNA未完全沉淀，重復(fù)離心，直至大分子DNA沉淀全部清除為止。

9．取上清，加0.6體積的異丙醇，混合后置室溫下10分鐘。

10．室溫下8000rpm離心15分鐘（不要4℃離心，否則鹽會(huì)沉淀！）。取沉淀用70%乙醇洗二次，倒置離心管干燥。

11．DNA回溶在TE內(nèi)（每500ml菌液加3ml），混合后室溫下30分鐘（此步可停）。

12．將溶解后的提取物移至15-30ml的離心管內(nèi)，加等體積（3 ml）冷的5M LiCl，混合后置冰上2-5分鐘。4℃下10000rpm離心10分鐘（沉淀大分子RNA）。

13．將上清移至干凈的離心管內(nèi)（30-50ml的離心管），加等體積的異丙醇，混合均勻，室溫下沉淀5-10分鐘（搖兩次）。室溫下以10000rpm離心10分鐘。

14．倒掉上清，倒置離心管以除去殘余的上清。用70%乙醇洗2次（室溫），倒置離心管干燥幾分鐘蒸發(fā)乙醇。

15．沉淀溶于500ml的TE，加RNA酶A（終濃度為20mg/ml），將混合液移至1.5ml的小離心管內(nèi)，室溫下置30分鐘。

16．加500ml的1.6M NaCl(含13%的PEG8000)，混合均勻。置冰上2-5分鐘，于4℃下12000rpm離心5分鐘(回收質(zhì)粒DNA)。小心倒掉上清，將沉淀溶于400ml的TE中（此步可省略）。

17．用等體積的苯酚/氯仿異戊醇(25:24:1_V/V)抽提1次，取上清液，再用等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提一次。

18．將上層液小心吸出，置于干凈的1.5mL離心管內(nèi)。加100ml的10M NH₄Ac溶液，混合。再加2倍體積（約1ml）的無水乙醇，室溫下置10分鐘。

19．于室溫下12000rpm離心5分鐘。

20．小心吸去上清。加200ml的70%乙醇（4℃），振蕩幾秒鐘后，室溫下12000rpm離心5分鐘。重復(fù)一次，倒置離心管使乙醇蒸發(fā)（勿倒掉DNA沉淀?。?。

21．將沉淀溶于500ml的TE。取少量用TE稀釋50-1000倍，測OD₂₆₀，算出質(zhì)粒DNA的濃度（1OD260=50mg質(zhì)粒DNA/mL）。保存于-20℃內(nèi)待用。

方法二 大腸桿菌質(zhì)粒DNA的微量提?。ㄖ蠓蟹ǎ?/span>

1．將含有質(zhì)粒的大腸桿菌（農(nóng)桿菌）接種于含抗生素適量LB（YEP）培養(yǎng)基中，37℃（28℃），200rpm震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期。

2．取1ml菌液至1.5ml的離心管中, 12000rpm，離心1分鐘。

3．去上清,用80μl STET緩沖液懸浮菌體。

4．加入4ml溶菌酶（10mg/ml）。

5．沸水中煮1分鐘。

6．立即取出，室溫下12000 rpm離心10分鐘。

7．用牙簽將底部沉淀完全挑出，保留上清。

8．加入80μl冷的異丙醇混合均勻。

9．12000rpm，離心5分鐘，沉淀DNA。

10．小心倒掉上清，沉淀用70%乙醇洗2次，倒置干燥。

11．回溶于20ml TE中，取3ml用0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

方法三 大腸桿菌質(zhì)粒DNA的微量提?。▔A法）

1．將含有質(zhì)粒的大腸桿菌按5%量接種到液體5mL LB培養(yǎng)基 (含適量抗生素)內(nèi)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長晚期 (一般0D600=0.6)。   

2．懸浮菌液移至1.5mL離心管內(nèi)，室溫下4000rpm離心15分鐘，棄上清。若沉淀較少可重復(fù)收集1~2次。

3．用200μL “1號(hào)溶液”回溶菌塊。

4．加400μL新配置的“2號(hào)溶液”，顛倒混勻(不劇烈震蕩)。

5．每管加入300μL冷的“3號(hào)溶液”，充分混勻，在冰內(nèi)放置5分鐘，并搖動(dòng)混合3次。

6．12000rpm離心5分鐘。如染色體DNA未完全沉淀，重復(fù)離心，直至大分子DNA沉淀全部清除為止。

7．取上清，加0.6體積的異丙醇，混合后置室溫下10分鐘。

8．室溫下12000rpm離心5分鐘。

9．沉淀用70%乙醇洗二次，倒置離心管干燥，沉淀用70%乙醇洗兩次后，溶于20-50mL的TE備用。