近段時(shí)間，小新在做熒光探針檢測實(shí)驗(yàn)時(shí)，陰性對照經(jīng)常起線，也就是我們常說的“陰性抬頭”現(xiàn)象。

經(jīng)過總結(jié)發(fā)現(xiàn)有個(gè)規(guī)律：陰性對照起線的CT值都很大，并且也不是每次實(shí)驗(yàn)陰性對照都會(huì)起線。

于是開始懷疑是環(huán)境中有擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，但是我們的PCR實(shí)驗(yàn)室是嚴(yán)格按照三區(qū)隔離要求建設(shè)的，實(shí)驗(yàn)操作也都是按照要求進(jìn)行操作的，為什么還會(huì)有污染？這個(gè)污染究竟是從何而來的呢？

仔細(xì)回想了一下，之前小新由于好奇心，在某一次熒光擴(kuò)增完成之后，將擴(kuò)增產(chǎn)物拿去電泳了，難道就是由此在環(huán)境中形成了氣溶膠污染？

雖然電泳室也有專門的負(fù)壓通風(fēng)系統(tǒng)，也遠(yuǎn)離PCR實(shí)驗(yàn)室，但是電泳室隔壁的DNA實(shí)驗(yàn)室是開放式的，人員流動(dòng)量大，氣溶膠還是有可能從DNA實(shí)驗(yàn)室通過人員流動(dòng)帶入PCR實(shí)驗(yàn)室的。

為了驗(yàn)證這個(gè)猜想是否正確，小新設(shè)計(jì)了一個(gè)實(shí)驗(yàn)方法，接下來就讓我們看看到底是不是這個(gè)原因造成的污染吧。

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

驗(yàn)證陰性對照中的污染源來源。

二、實(shí)驗(yàn)材料

2×Probe qPCR Mix（Simgen Cat.No.7206100，Lot No.：20230229）

臺(tái)式小量離心機(jī)（eppendorf Centrifuge 5415D）

旋渦振蕩器(杭州米歐儀器有限公司XH-C)

電子恒溫不銹鋼水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）

超微量分光光度計(jì)（Simgen Cat.No.Sim-100）

超微量電子天平（福州華科電子儀器有限公司TP-213）

電泳儀（北京六一儀器廠DYY-6C型）

熒光PCR儀（ABI PRISM®7500）

三、實(shí)驗(yàn)方法

1. 對照組：讓生產(chǎn)技術(shù)員在遠(yuǎn)離PCR實(shí)驗(yàn)室的陰性生產(chǎn)車間用新開封的2×Probe qPCR Mix、引物、探針，按照下表配置熒光PCR反應(yīng)體系（不添加模板DNA），共8管。

2. 測試組：小新在DNA實(shí)驗(yàn)室同時(shí)用同一批次新開封的2×Probe qPCR Mix、引物、探針，按照下表配置熒光PCR反應(yīng)體系（不添加模板DNA），共8管。

3. 在ABI PRISM®7500熒光PCR儀中進(jìn)行熒光定量PCR。實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下：

Stage 1： 預(yù)變性（Reps：1）

95℃  30秒

Stage 2： PCR反應(yīng)（Reps：40）

95℃  10秒

60℃  30秒

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果如下圖：

五、實(shí)驗(yàn)結(jié)論

1. 從圖中可以得知對照組的8個(gè)樣本均未起線，說明新拆封的試劑、以及陰性生產(chǎn)車間都是沒有污染源的。而測試組的8個(gè)樣本中除了2個(gè)樣本未起線外，其余6個(gè)樣本均起線了，更重要的是這6個(gè)起線樣本中有2個(gè)樣本的CT值都接近34了，而原來在PCR室配制的陰性PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增出現(xiàn)的陽性CT值無一例外都是大于35的。現(xiàn)在基本上可以判定DNA實(shí)驗(yàn)室就是環(huán)境中污染源的源頭了，當(dāng)然DNA實(shí)驗(yàn)室的污染又來自隔壁的電泳室。

2. 這次實(shí)驗(yàn)讓我們見識(shí)了氣溶膠的厲害，竟然在我們專業(yè)的PCR實(shí)驗(yàn)都碰到氣溶膠的污染！所以說，PCR檢測的超高靈敏度是把雙刃劍，要應(yīng)用這一技術(shù)的超高靈敏度，就必須注意實(shí)驗(yàn)過程中的每一個(gè)可能導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物污染的環(huán)節(jié)。為此，我們實(shí)驗(yàn)室立即啟動(dòng)了下述幾項(xiàng)應(yīng)急的糾正預(yù)防措施：

1） DNA實(shí)驗(yàn)室開窗、開門通風(fēng)，持續(xù)兩周時(shí)間以上。

2） 下班時(shí)間PCR實(shí)驗(yàn)室、DNA實(shí)驗(yàn)室用紫外線照射，持續(xù)一周時(shí)間。

3） 暫停相關(guān)檢測實(shí)驗(yàn)，除陰性車間拆封過的試劑外，其他相關(guān)的檢測試劑全部丟棄。

4） 熒光PCR檢測后的產(chǎn)物原則上不允許開蓋電泳檢測。如果有需求，則要求在電泳結(jié)束后及時(shí)開啟紫外燈變性可能存在環(huán)境中的氣溶膠，同時(shí)更換電泳緩沖液，然后還須將擴(kuò)增產(chǎn)物、凝膠、吸頭單獨(dú)用自封袋密封后再丟棄。

5） 嚴(yán)格遵循在不同實(shí)驗(yàn)室工作需要更換不同工作服的規(guī)定。

3. 熒光PCR檢測理論上能檢測到1個(gè)DNA分子，所以同學(xué)們請牢記一點(diǎn)，如無必要請千萬不要開蓋、不要開蓋、不要開蓋?。。?/span>----重要的事情說三遍。否則一旦發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)環(huán)境出現(xiàn)氣溶膠污染了，就需要更換試劑，紫外線照射，實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)，非常之麻煩，即便有專用的電泳室，也不要輕易嘗試。