某天跟客戶閑聊的時(shí)候，客戶突然提出了一個問題，“我們用T***gen的高多糖多酚試劑盒，通常洗脫體積30 μl，得到的RNA濃度也就100多ng/μl，到200 ng/μl的時(shí)候很少，做反轉(zhuǎn)錄總會覺得不夠用，而且他們的試劑盒，研磨完加入裂解液，會變成特別粘稠的鼻涕狀，吸上清的時(shí)候特別費(fèi)勁”。

于是我們從客戶那邊要來了樣本，帶回公司進(jìn)行了研究。那么是否是因?yàn)楫a(chǎn)品的不同而產(chǎn)生的差異呢？接下來就讓我們通過實(shí)驗(yàn)來尋找答案吧。

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

從閩楠葉片中提取RNA。

二、實(shí)驗(yàn)材料：

新鮮閩楠葉片

研缽

高多糖多酚植物總RNA試劑盒（Simgen,Cat.No. 5103050）

DNase Ⅰ柱上消化試劑盒（Simgen,Cat.No. 8010050）

三、實(shí)驗(yàn)方法

本次實(shí)驗(yàn)嘗試用高多糖多酚植物總RNA試劑盒和DNase Ⅰ柱上消化試劑盒（Simgen,Cat.No. 8010050）提取閩楠葉片RNA。

高多糖多酚植物總RNA試劑盒中插入DNase Ⅰ柱上消化試劑盒操作提取步驟

1. 在研缽中稱取200 mg植物組織，加入液氮，將組織研磨至粉末狀，再用液氮預(yù)冷的1.5 ml離心管稱取50 mg研磨成粉末狀的組織。

* 研磨組織時(shí)應(yīng)及時(shí)補(bǔ)加液氮，避免組織融化，以免內(nèi)源性的RNA酶恢復(fù)活性而降解RNA。

2. 加入600 μl已加入β-巰基乙醇的Buffer RCT，旋渦振蕩直至組織全部溶解。

3. 加入600 μl Buffer EX，用力混合均勻，12000 rpm離心5分鐘。

4. 小心吸取350 μl上清液，轉(zhuǎn)入一個潔凈的1.5 ml離心管中。

5. 在上清液中加入350 μl Buffer K并直接用吸頭吸注6-8次混合均勻，將混合液全部轉(zhuǎn)移到過濾柱中，蓋上管蓋，13000 rpm離心1分鐘。

6. 棄過濾柱，向?yàn)V液中加入700 μl 70％乙醇并直接用吸頭吸注6-8次混合均勻，吸取700 μl混合液加入到核酸純化柱中，蓋上管蓋，13000 rpm離心1分鐘。

7. 棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，吸取剩余的混合液加入到核酸純化柱中，13000 rpm離心1分鐘。

8. 棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，在核酸純化柱中加入500 μl Buffer WA，蓋上管蓋，13000 rpm離心1分鐘。

9. 每個反應(yīng)取5 μl DnaseⅠ、45 μl Buffer RDD配制柱上消化孵育液，勿棄吸頭，直接用移液器溫和地吹打幾次混合均勻。

10. 棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，向吸附柱中央加入50 μl步驟9配好的孵育液，室溫(20-30℃)放置15 min。

11. 加入500 μl Buffer WA，蓋上管蓋，12000 rpm離心30秒。

12. 棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，在核酸純化柱中加入600 μl Buffer WBR，蓋上管蓋，13000 rpm離心1分鐘。

13. 棄2 ml離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2 ml離心管中，14000 rpm離心1分鐘。

14. 棄2 ml離心管，將核酸純化柱置于一個潔凈的RNase-free的1.5 ml離心管中，在純化柱的膜中央加入50 μl RNase-free Water，蓋上管蓋，室溫靜置1分鐘，13000 rpm離心1分鐘。

15. 棄純化柱，洗脫的RNA可立即用于各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)；或者將RNA儲存于﹣70℃以下備用。

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

                                                       樣本1、2、3均來自同一株閩楠

2. 在1%的瓊脂糖凝膠上，加入5 μl提取到的RNA，電泳20 min，結(jié)果如下：

五、討論與分析：

從結(jié)果上分析，Simgen高多糖多酚總RNA試劑盒能提取到閩楠葉片RNA，且RNA的得率相對T***gen產(chǎn)品有顯著提高。

客戶提出的“閩楠葉片經(jīng)過液氮研磨加入裂解液后會變得十分粘稠，像鼻涕狀，難以吸取上清”，這是由于閩楠葉片中含有較多的多糖（特別是淀粉類物質(zhì)）衍生物的干擾，也證明了T***gen產(chǎn)品對于閩楠這一樣本RNA提取的局限性。

閩楠葉片由于纖維化較嚴(yán)重，且本身RNA的含量就相對較低，而Simgen高多糖多酚總RNA試劑盒操作步驟較為簡單，不存在上清吸不上來的問題，且RNA提取得率較高，完美適應(yīng)閩楠葉片RNA的提取。這時(shí)候選用Simgen高多糖多酚總RNA試劑盒提取RNA確實(shí)是省時(shí)省力的好辦法。