熒光PCR法檢測(cè)RNasin性能效果

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/span>對(duì)RNasin性能效果進(jìn)行檢測(cè)及評(píng)估。

實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備

模板RNA：大鼠肌肉組織RNA

引物：Rat β-acting：Forward CCCATCTATGAGGGTTACGC

                     Reverse  TTTAATGTCACGCACGATTTC 

RNase：50mg/ml（simgen）

RNasin：40U/μl

cDNA第一鏈合成試劑盒（simgen）、2×SYBR Green PCR mix（simgen）

設(shè)備：ABI 7000 熒光PCR儀、普通PCR儀、離心機(jī)及移液器

其他耗材：0.6ml離心管，八連排管，RNase-free吸頭，一次性手套及防護(hù)用品和紙巾。

實(shí)驗(yàn)方法：利用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA及SYBR Green熒光PCR方法對(duì)RNasin產(chǎn)品的性能效果進(jìn)行檢測(cè)評(píng)估。

實(shí)驗(yàn)方案：

設(shè)計(jì)思路：

1. 編號(hào)1-4為測(cè)試同一批RNasin的性能，1號(hào)與3號(hào)是測(cè)試相同RNA量和RNase量，加不加RNasin對(duì)cDNA合成的影響，即RNasin抑制RNase的活性效果。

2. 4號(hào)是表示在不添加RNase和RNasin時(shí)的空白對(duì)照。

3. 2號(hào)與3號(hào)是測(cè)試在相同RNA量和RNasin量的條件下，改變RNase的量，RNasin對(duì)不同量的RNase的抑制效果有什么變化。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1.將模板RNA在冰上解凍；5×gDNA Buffer、RNasin、RNA(500ng/ul)、RNase、RNA-FreeH₂O、5×RT Buffer、RT-Enzymemix、RT-Primer mix 、2×SYBR Green PCR Mix、引物、在室溫（15-25℃）解凍，解凍后迅速置于冰上。使用前將每種溶液渦旋振蕩混勻，簡(jiǎn)短離心以收集殘留在管壁的液體。

注：RNase稀釋需在抽風(fēng)口或遠(yuǎn)離PCR操作室的實(shí)驗(yàn)室。

2. 按照表1的基因組DNA的去除體系配制混合液，徹底混勻。簡(jiǎn)短離心，并置于42℃，孵育30min，以保證RNase有充分時(shí)間去降解RNA.然后置于冰上放置。

表1 gDNA去除反應(yīng)體系

注：1.RNA的濃度是500ng/μl,RNA的濃度不能太低，且RNA需在RNase之前添加，否則可能被RNase降解完從而在熒光PCR上反映不出差異。

    2.RNase的濃度分別為1ng/μl和10ng/μl，故在加入RNase時(shí)均加入2μl，保證不同的量相同體積，以減少誤差，在加RNase的時(shí)候應(yīng)盡量在無(wú)RNase的環(huán)境中添加，以免環(huán)境中RNase過(guò)多而導(dǎo)致RNA降解嚴(yán)重從而在熒光PCR上反映不出差異。

    3. RNasin的濃度為40U/μl，添加RNasin應(yīng)在加RNA之前添加。

 后續(xù)cDNA合成步驟參考cDNA第一鏈合成試劑盒（simgen）說(shuō)明書(shū)操作。所得cDNA稀釋5倍，置于冰上備用。

 熒光PCR步驟參考2×SYBR Green PCR Mix（simgen）說(shuō)明書(shū)操作。

 將稀釋好的cDNA模板按照5μl/管加入到熒光PCR反應(yīng)體系混合液中，進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

從上圖看，在加2ng RNase時(shí)，加不加RNasin對(duì)cDNA的合成是有明顯影響的，即3號(hào)比1號(hào)的CT值要小6個(gè)CT，表示它們的起始cDNA濃度相差大概2⁶倍,說(shuō)明RNasin對(duì)RNase的影響是非常大的。

從2號(hào)與3號(hào)對(duì)比，說(shuō)明在相同量的RNasin下，當(dāng)RNase的量增加到20ng時(shí)，80U RNasin的效果還不足將RNase完全抑制，說(shuō)明一定量的RNasin只能對(duì)一定量的RNase有足夠的抑制作用。

                                                    操作人：昌青青、徐文彪

                                                 日  期：2015-10-09