新景實(shí)驗(yàn)室在去年時(shí)接到一些質(zhì)粒提取的技術(shù)服務(wù)，其中有相當(dāng)一部分是低拷貝質(zhì)粒的細(xì)菌，這些細(xì)菌過(guò)夜培養(yǎng)后（OD600=3.2）的每毫升菌液一般只能提到2微克左右的質(zhì)粒。就是說(shuō)如果我們需要提取2mg的質(zhì)粒，我們就需要培養(yǎng)1L以上的菌液來(lái)提取，但這只是在100%提取效率的理論狀態(tài)下所需的量，而實(shí)際操作中是不可能達(dá)到100%地提取到所有的質(zhì)粒，一般最多能得到80%-90%的提取率，我們先看一下下表數(shù)據(jù)：

1、2為3ml細(xì)菌進(jìn)行質(zhì)粒小提，60μl洗脫得到的質(zhì)粒DNA；3、4為100ml細(xì)菌進(jìn)行質(zhì)粒中抽，2ml洗脫得到的質(zhì)粒DNA；5、6是2ml質(zhì)粒中抽的DNA溶液進(jìn)行DNA濃縮，100μl洗脫得到的質(zhì)粒DNA。

從上表可以看到我們用100ml菌液進(jìn)行一次質(zhì)粒中抽，只能得到115μg左右的高濃度質(zhì)粒DNA，就是說(shuō)我們要提2mg的質(zhì)粒就需要培養(yǎng)2L左右的菌液，要進(jìn)行20次左右的質(zhì)粒中抽。這樣不僅耗時(shí)長(zhǎng)，而且成本高，效率低，那么怎樣才能提高低拷貝質(zhì)粒的提取效率呢？

小編通過(guò)查找文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)一種可以提高低拷貝質(zhì)?？截悢?shù)的方法，就是在細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的時(shí)候加入氯霉素，因?yàn)槁让顾貢?huì)抑制蛋白質(zhì)合成，從而抑制細(xì)菌的繁殖，但是卻不會(huì)抑制細(xì)菌的質(zhì)粒合成，故此時(shí)細(xì)菌中的質(zhì)粒仍可以復(fù)制合成。

為了驗(yàn)證，小編做了一些實(shí)驗(yàn)，首先挑取單菌落至5ml菌液中（2支），加入對(duì)應(yīng)抗生素，37℃220rpm 培養(yǎng)2-3h，將兩支菌液各全部轉(zhuǎn)入300ml含相應(yīng)抗生素的菌液中37℃220rpm 培養(yǎng)6-8h，此時(shí)細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，然后向其中一瓶加入氯霉素至終濃度為170μg/ml，兩瓶菌液37℃220rpm 繼續(xù)培養(yǎng)12-16h左右。

然后取3ml菌液各兩支以及相同干重量細(xì)菌各兩支，編上編號(hào)，進(jìn)行質(zhì)粒DNA小提，60μl洗脫得到的質(zhì)粒DNA并測(cè)OD，結(jié)果如下表：

1、2為3ml正常培養(yǎng)的菌液，3、4為3ml含氯霉素的菌液，5、6為5mg干重正常培養(yǎng)的菌體，7、8為5mg干重含氯霉素的菌體。

從上表中我們可以看出，在相同菌液量的時(shí)候，質(zhì)粒DNA總量并無(wú)多大提高，而在相同菌體干重下卻有很大的提高，這是因?yàn)?strong>氯霉素抑制細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖導(dǎo)致每毫升菌液中細(xì)菌少，又因?yàn)槁让顾夭粫?huì)抑制質(zhì)粒DNA的復(fù)制合成，所以相同細(xì)菌個(gè)數(shù)下質(zhì)粒DNA量提高了。

在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中我們必須注意幾點(diǎn)：

1. 細(xì)菌必須是含松弛型低拷貝質(zhì)粒DNA，如果是嚴(yán)緊型細(xì)菌，就不能用這種方法，因?yàn)檫@種質(zhì)粒DNA的復(fù)制是隨著細(xì)菌染色體復(fù)制而復(fù)制合成的；

2. 細(xì)菌必須在細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期加入氯霉素，因?yàn)檫^(guò)早加入時(shí)，細(xì)菌量太少，無(wú)法太多的細(xì)菌用以提取質(zhì)粒DNA，而超過(guò)這個(gè)時(shí)期，細(xì)菌量過(guò)多，菌量達(dá)到飽和，部分菌體停止復(fù)制合成質(zhì)粒DNA，此時(shí)加入氯霉素，效果已經(jīng)不明顯了；

3. 在細(xì)菌培養(yǎng)的操作過(guò)程中要保證無(wú)菌操作，避免雜菌污染；

好了，今天的新景實(shí)驗(yàn)室：分子生物百科就到這里了，希望今天的內(nèi)容能對(duì)大家今后提取低拷貝質(zhì)粒有所幫助，我們下期再見(jiàn)??！

                                               2016年3月11日

                                                 新景生物實(shí)驗(yàn)室