“酶：大多是蛋白質(zhì)，但少數(shù)具有生物催化功能的分子并非為蛋白質(zhì)，有一些被稱為核酶的RNA分子也具有催化功能。此外，通過人工合成所謂人工酶也具有與酶類似的催化活性，包括人工合成的DNA。 有人認(rèn)為酶應(yīng)定義為具有催化功能的生物大分子，即生物催化劑……”邊看書邊打瞌睡的小新實(shí)在熬不住了，把書扔了，還是去實(shí)驗(yàn)室點(diǎn)小實(shí)驗(yàn)比較有意思?！厩f不要學(xué)小新不愛讀書，隔三差五要被領(lǐng)導(dǎo)教育QAQ】

實(shí)驗(yàn)室里圍了一圈同事，原來是前幾天新訂的Taq酶到貨了，可是拿到東西的大師兄在做實(shí)驗(yàn)的過程中犯了難。忍不住好奇的小新也把腦袋伸了過去。

原來是因?yàn)榻诘募夹g(shù)服務(wù)需要做一個(gè)細(xì)菌16s的擴(kuò)增，但是不同濃度的試驗(yàn)樣本做出來的結(jié)果居然都是一樣的，小新死皮賴臉的把這份不正常的結(jié)果拿來了，情況確實(shí)很糟糕：大師兄的試驗(yàn)采用梯度稀釋的樣本，分別由1稀釋到10^-6，但是從試驗(yàn)結(jié)果來看，各個(gè)樣本的CT值均圍繞在15-17之間，也就是說，從熒光結(jié)果上完全看不出任何樣本差異?。?/span>

引物序列：（F）TGTGTAGCGGTGAAATGCG

（R）TCGTTTACGGCGTGGAC        該段引物序列擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為138bp

為了搞清楚為什么，小新開始重復(fù)大師兄的試驗(yàn)，出來的結(jié)果依舊如此，排除實(shí)驗(yàn)員操作的問題，那就是體系的原因了。正準(zhǔn)備逐一排查到底是哪個(gè)實(shí)驗(yàn)成分有問題時(shí)，小新發(fā)現(xiàn)了對(duì)照組陰性【就是沒有加入DNA模板的那組】居然和其他組的結(jié)果一樣，那就說明是體系里混進(jìn)去了其他的DNA模板，并且是細(xì)菌的DNA模板。由于換了新的Taq酶才開始出現(xiàn)這種結(jié)果，那么頭號(hào)懷疑對(duì)象當(dāng)然就是新的Taq酶咯。

問了一下師兄，現(xiàn)在的Taq酶是哪家公司的，師兄說是JL的，恰好小新手上還有一些其他公司的Taq酶，那就正好來個(gè)大檢查，看看到底是哪家公司的Taq酶混進(jìn)去的DNA最多，還是大家生產(chǎn)的酶都混進(jìn)去了很多DNA。

試驗(yàn)過程倒是很簡(jiǎn)單，通過簡(jiǎn)單的陰性試驗(yàn)就能出來結(jié)果。

小新選取了四種不同公司的酶：1、萊楓，2、JL，3、康為，4、TaKaRa，采用引物序列依舊是16s的通用引物。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了全陰性試驗(yàn)。一個(gè)多小時(shí)的等待，實(shí)驗(yàn)結(jié)果終于出來了。

圖中的熒光線從前往后所用的酶依次是：JL、康為、TaKaRa、萊楓

觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)CT值的分析，JL的CT值最為靠前，也就是說其含細(xì)菌DNA濃度最高，其余三家公司的Taq酶也都存在DNA殘留。也就是說無論是哪家公司的Taq酶都無法做出真正意義上的陰性結(jié)果。那么這樣的Taq酶對(duì)普通的16sPCR擴(kuò)增是否也存在影響呢？好奇的小新進(jìn)行了16s普通 PCR全陰性擴(kuò)增，再對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，出來的結(jié)果如圖：

注：普通的16s 采用的引物序列為： F  AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

R  GGCTACCTTGTTACGACTT

該段引物序列擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為1497bp

從電泳圖可以清晰的看出，JL、康為和TaKaRa公司產(chǎn)出Taq酶在進(jìn)行陰性16s擴(kuò)增時(shí)，也會(huì)出現(xiàn)隱約的條帶當(dāng)然，這并不排除環(huán)境中細(xì)菌DNA的污染。

結(jié)論：作為Taq酶生產(chǎn)廠家都會(huì)盡力設(shè)法去除殘留的大腸桿菌基因組DNA。但是有Taq酶生產(chǎn)廠家曾表示，Taq酶由于本身就會(huì)結(jié)合一部分DNA，因此Taq酶殘留的幾百bp細(xì)菌DNA是無法徹底去的除，本次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該廠家的論述，同時(shí)也說明用擴(kuò)增短片段的通用性16s細(xì)菌引物檢測(cè)細(xì)菌數(shù)量是不可靠的，應(yīng)當(dāng)設(shè)計(jì)特異性的細(xì)菌引物檢測(cè)細(xì)菌，才能使試驗(yàn)結(jié)果更具有說服性。好啦，這期的小新課堂結(jié)束了，我們下期再會(huì)！