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如果大家拿到一株未知真菌，想檢測真菌種屬，該怎么做呢？今天小編就在這里為大家講一下未知真菌的DNA提取、凝膠回收、測序分析及進化樹的繪制。
一、準備實驗試劑及儀器：
1．DNA提?。?a href="http://9nme9.cn/product/2.html">植物DNA試劑盒（simgen，Cat.No.3201-050），液氮；
2．PCR 試劑：2 × Taq PlusPCR Master Mix（Simgen，Cat.No.7005100），
引物（ITS 1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG
ITS 4：TCCTCCGCTTATTGATATGC）；
3．DNA Marker：DL2000 Ladder（simgen，Cat.No.MD1006）；
4．PCR產物純化：凝膠DNA回收試劑盒（simgen，Cat.No.2001-050）；
5．實驗儀器：水浴鍋，離心機，研缽，電泳儀，PCR儀，移液器，Sim-100超微量紫外分光光度計（simgen，Sim-100）。
注：1. 植物DNA試劑盒（simgen，Cat.No.3201-050）可用于真菌DNA提??；
2. 引物由Invitrogen公司合成。
二、DNA的提取及濃度測定：
1． 將真菌從培養(yǎng)基上刮下或從菌液中收集，轉至研缽中，加入液氮研磨至面粉狀；
2． 研磨充分后加入500μl 65℃預熱的Buffer PL，繼續(xù)研磨一段時間，取500μl混合液至潔凈的1.5ml離心管中（若不足500μl 混合液，加Buffer PL補至500μl ）；
3． 接下的步驟按照植物DNA試劑盒（simgen，Cat.No.3201-050）說明書操作，100μl Buffer TE洗脫DNA；
4． 測OD。
真菌DNA提取結果：
編號 | OD260 | OD280 | OD230 | 260/230 | 260/280 | 濃度(ng/μl) |
1 | 2.82 | 1.49 | 1.32 | 2.14 | 1.90 | 140.92 |
2 | 2.21 | 1.19 | 1.07 | 2.07 | 1.86 | 110.54 |
三、PCR擴增及回收純化：
1． 按下表配置PCR體系
試劑 | 用量 |
2× Taq PCR MASTER Mix（Simgen） | 20μl |
Primer 1（10mM） | 1μl |
Primer 2（10mM） | 1μl |
ddH2O | 13μl |
Template | 5μl |
2. PCR反應程序：
PCR 反應條件
3. 電泳檢測及凝膠回收：
PCR產物電泳圖：
凝膠回收：
A. PCR產物電泳，并切膠（注：膠最好切得薄一點）；
B. 按照凝膠DNA回收試劑盒（simgen）說明書操作，30μl Buffer TE洗脫DNA,并測OD值。
凝膠回收DNA結果：
編號 | OD260 | OD280 | OD230 | 260/230 | 260/280 | 濃度(ng/μl) |
1 | 2.331 | 1.262 | 1.839 | 1.27 | 1.85 | 116.53 |
2 | 2.265 | 1.231 | 2.063 | 1.10 | 1.84 | 113.24 |
四、將凝膠回收產物送測序公司測序
測序結果繪制進化樹：
從以上實驗結果可以分析得到此真菌與比對到的真菌有非常近的親緣關系，應該也是屬于Paecilomyces。
如有不理解的，可以聯(lián)系杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司技術部：892873021@qq.com。
新景生物實驗室
2016年04月20日
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