小新作為技術(shù)員，在進(jìn)行SYBRGreen熒光PCR時(shí)也會(huì)經(jīng)常碰到和顧客們一樣的問題，好好的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果熒光跑完了會(huì)出現(xiàn)一些奇怪的熒光曲線，那么面對(duì)這樣的結(jié)果，我們應(yīng)該怎么來分析呢？接下來，小新帶大家看一些“不規(guī)矩”的熒光曲線，并一起來分析分析原因。

首先來看這種熒光曲線：

看到這一堆亂七八糟的線是不是就頭大？實(shí)際上這些樣本是存在一定的濃度梯度的【小新是按照10倍、100倍、1000倍這樣稀釋的】，然而這些樣本在實(shí)驗(yàn)結(jié)果上看不出相應(yīng)的差異，并且有些線在PCR后期會(huì)出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。這樣的結(jié)果基本上顯示了樣本DNA濃度過高，因?yàn)闊晒?/span>PCR儀檢測到熒光存在一個(gè)閾值【小新采用的這款儀器，它開始能夠接受的熒光起始值圍繞在15左右】，如果DNA濃度過高的話，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增的前面幾個(gè)循環(huán)，儀器就已經(jīng)開始能夠檢測到熒光，導(dǎo)致所有的曲線全都堆積在一起，無法分開。面對(duì)這種情況，小新建議大家多稀釋一些梯度【擴(kuò)大稀釋倍數(shù)也可啊】，努力做到讓曲線分開。

第二種曲線乍看上去非常正?！?/span>

有木有覺得很完美？？？?。?！

但是如果小新告訴大家，這兩條線其實(shí)有一個(gè)是陰性對(duì)照，你們是不是就懵圈了呢？

實(shí)際上的樣本是這樣的！

肯定有小伙伴說你肯定在逗我吧！其實(shí)出現(xiàn)這種線的情況并不少見，多存在于熒光PCR的引物測試過程中。由于引物設(shè)計(jì)的不完美，導(dǎo)致PCR擴(kuò)增過程中出現(xiàn)引物二聚體。當(dāng)然除了看熒光曲線以外，還可以用融解曲線為佐證（不知道啥是融解曲線的小伙伴可以自行百度，度娘解釋的很清楚喲！）。

從圖上就可以明顯看出陰性對(duì)照與陽性對(duì)照的峰值并不在一起，也就是說陰性對(duì)照出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，這個(gè)陰性的峰值就是引物二聚體的融解溫度。所以小伙伴們?cè)谧稣降臒晒?span >PCR實(shí)驗(yàn)之前，一定要記得進(jìn)行引物測試，以免遇到這種情況哦！

最后一種曲線就相對(duì)簡單的多了

接下來再看看它們的融解曲線（毫無章法的任性曲線)

大部分小伙伴看到這種曲線的第一反應(yīng)就是：這明顯是陰性對(duì)照嘛！是的，圖上這三條曲線的樣本均為陰性測試但是這三條線在結(jié)尾還是出現(xiàn)了起線，我們?cè)谝话闱闆r下也視為陰性，那么它出現(xiàn)起線的主要原因是什么呢？由于擴(kuò)增體系中Mg離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR循環(huán)次數(shù)等多重因素都會(huì)導(dǎo)致這種現(xiàn)象的發(fā)生。其次酶量過多有時(shí)也容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。

好啦，今天的小新課堂講述了好多新的科普知識(shí)，希望小伙伴們?cè)趯W(xué)習(xí)的過程中也能夠和小新多多交流，小新歡迎大家來信對(duì)小新課堂進(jìn)行評(píng)價(jià)和指導(dǎo)！（畢竟小新也是個(gè)愛好學(xué)習(xí)的好孩紙！這是小新的郵箱：technical@simgen.cn 記得給我來信哦。么么噠！