隨著2019年底在武漢出現(xiàn)的由新型冠狀病毒引起肺炎的疫情發(fā)展至全國(guó)，新型冠狀病毒核酸檢測(cè)診斷試劑盒需求量也激增。病毒核酸檢測(cè)由兩塊內(nèi)容組成：核酸提取+PCR檢測(cè)，對(duì)于病毒RNA檢測(cè)來(lái)說(shuō)，病毒RNA提取反而是核酸檢測(cè)的重頭戲。因?yàn)椴《?/span>RNA的數(shù)量很低（pg級(jí)別）且容易降解，提取過(guò)程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，以至于提取的病毒RNA的效率直接就決定了檢測(cè)的靈敏度。本文以實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)比方式說(shuō)明如何提高病毒核酸檢測(cè)靈敏度。

 下面是中國(guó)疾控中心公布的檢測(cè)新冠病毒的引物、探針序列：

推薦選用針對(duì)新型冠狀病毒的開(kāi)放讀碼框1ab（open reading frame,ORF1ab）、核殼蛋白（nucleoprotein，N）基因區(qū)域的引物和探針。

Target 1（ORF1ab）:

正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA

反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA

熒光探針（P）：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'

Target 2（N）:

正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT

反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG

熒光探針（P）：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'

也就是說(shuō)如果大家手頭有類似Simgen的2×One Step Probe RT-PCR Mix（Cat. No. 406100），合成引物探針后，就可以自制新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒了。如前文所說(shuō)，核酸檢測(cè)由兩塊內(nèi)容組成：核酸提取+PCR檢測(cè)，病毒RNA提取是核酸檢測(cè)的重頭戲。因?yàn)椴《?/span>RNA的數(shù)量很低（pg級(jí)別）且容易降解，提取病毒RNA的效率直接就決定了檢測(cè)的靈敏度。所以一些不負(fù)責(zé)任的核酸診斷試劑盒廠家采用了逃避手法：只提供熒光PCR檢測(cè)試劑，讓用戶自己去找核酸提取方法……好吧，假如你運(yùn)氣不好，需要自己選擇病毒核酸提取方法或你診斷試劑盒廠家但遇到病毒核酸檢測(cè)靈敏度低問(wèn)題，此文章應(yīng)該挺有價(jià)值。

新景實(shí)驗(yàn)室接下來(lái)用三種方法做病毒RNA提取，來(lái)說(shuō)明提高新型冠狀病毒檢測(cè)靈敏度的有效方法。這三種病毒RNA提取方法分別是：

1）一般實(shí)驗(yàn)室最常見(jiàn)的Trizol試劑來(lái)進(jìn)行病毒RNA的提取;

2）Trizol試劑 添加Carrier RNA來(lái)進(jìn)行病毒RNA的提取;

3）病毒核酸純化試劑盒來(lái)進(jìn)行病毒RNA的提取（含Carrier RNA）;

（需要說(shuō)明的一點(diǎn)是：我們新景實(shí)驗(yàn)室不是P3實(shí)驗(yàn)室，不敢玩新冠病毒，我們以同樣是RNA病毒的丙肝病毒血清樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)試的，請(qǐng)大家諒解。）

一、樣本、試劑與儀器

1、  丙肝病毒陽(yáng)性血清，****醫(yī)院檢驗(yàn)科提供，經(jīng)達(dá)安基因公司丙型肝炎病毒(HCV)核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎ?/span> 產(chǎn)品檢測(cè)病毒濃度為10⁵ copies/ml。

用混合的人陰性血清將10⁵ copies/ml丙肝病毒陽(yáng)性血清病毒稀釋10倍獲得10⁴ copies/ml血清；再用混合的人陰性血清將10⁴copies/ml丙肝病毒陽(yáng)性血清病毒稀釋10倍獲得10³ copies/ml血清。

2、 Simgen病毒核酸純化試劑盒（Cat. No. 4002050）;
Simgen Trizol試劑（Cat. No. 5301100）;
Simgen Carrier RNA（Cat. No. 4003101）

3、 HCV檢測(cè)試劑盒：Acon丙型肝炎病毒核酸定量測(cè)定試劑盒(PCR-熒光法)

4、 PCR儀：ABI PRISM® 7000 Sequence Detection System

5、 離心機(jī)：Thermo Biofuge pico

二、測(cè)試方法

1、用Simgen病毒核酸純化試劑盒、Trizol加Carrier RNA、Trizol試劑分離純化同一管10³ copies/ml血清樣本中的病毒RNA。（Trizol提取方法：1ml Trizol試劑/1ml Trizol試劑含3 μl Carrier RNA + 200 μl血清混勻→+氯仿混勻→離心取750 μl上清+600 μl異丙醇→離心后用75%乙醇洗滌→50 μl RNase-free水溶解，具體細(xì)節(jié)請(qǐng)自行腦補(bǔ)）

2、三種方法均每次均從200 μl血清中分離純化病毒RNA，各重復(fù)一管，RNA最終洗脫/溶解體積為50 μl。

3、 三種病毒RNA提取方法獲得的病毒RNA均取10 μl作為模板擴(kuò)增，終反應(yīng)體積為40 μl，使用同一批次的Acon丙型肝炎病毒核酸定量測(cè)定試劑盒(PCR-熒光法)進(jìn)行擴(kuò)增。（注：Acon丙型肝炎病毒核酸定量測(cè)定試劑盒(PCR-熒光法)RT-PCR實(shí)際循環(huán)數(shù)為45個(gè)循環(huán)，反應(yīng)條件如下：42℃ 30min,  95℃ 3min,  [95℃ 10sec, 55℃ 30sec, 72℃ 1min(5次循環(huán))]，[95℃ 5sec, 60℃ 32sec (40次循環(huán))]）

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、 反應(yīng)體系的陰性對(duì)照中加10 μl 水作為模板，檢測(cè)結(jié)果為陰性。

 2、 用不同方法提取的10³copies/ml血清樣本，檢測(cè)結(jié)果如下圖：

四、分析與討論

1. 從檢測(cè)結(jié)果看，Trizol試劑終究還是擴(kuò)增起線了，只是CT值很大，趴下去了。Trizol試劑加了Carrier RNA后起線正常。但是比病毒核酸純化試劑盒大了差不多兩個(gè)CT值。

2. Trizol試劑在提取10³ copies/ml血清樣本的時(shí)候，起線艱難，我們很擔(dān)心提取10² copies/ml血清樣本的時(shí)候還能不能起線，所以我建議那些宣傳自己產(chǎn)品檢測(cè)靈敏度高達(dá)10² copies/ml的廠家，是不是要限制一下配套的病毒核酸提取方法，否則有虛假宣傳的嫌疑。

3. Trizol試劑加了Carrier RNA后，起線簡(jiǎn)直有了質(zhì)的飛越，怎么解釋？其實(shí)也簡(jiǎn)單：pg級(jí)的病毒RNA沉淀效率太低了，但是在純化體系中加了μg級(jí)的Carrier RNA后，沉淀病毒RNA效率完全就不是一個(gè)級(jí)別的了，我們一起看下照片：

大家都知道，RNA比DNA要脆弱得多，很容易降解，當(dāng)然100℃不失活的強(qiáng)悍RNA酶是罪魁禍?zhǔn)祝?/span>Carrier RNA的存在，對(duì)于掩護(hù)病毒RNA不被RNA酶攻擊，也是有重大意義的。Trizol試劑提取的病毒RNA擴(kuò)增曲線趴倒，不排除病毒RNA被降解，導(dǎo)致擴(kuò)增困難的可能性。

4．雖然Trizol試劑加了Carrier RNA后起線好了很多，但是和病毒核酸純化試劑盒（含 Carrier RNA）比較，還是大了兩個(gè)CT值，也就是說(shuō)病毒核酸純化試劑盒提取病毒RNA的效率是Trizol試劑+Carrier RNA的4倍，怎么解釋呢？這要從Trizol試劑提取RNA的原理說(shuō)起：Trizol是硫氰酸胍+苯酚+乙酸的混合物，硫氰酸胍負(fù)責(zé)變性溶解蛋白（對(duì)于病毒顆粒最有價(jià)值的是溶解蛋白外殼）；苯酚負(fù)責(zé)萃取變性的蛋白質(zhì)；乙酸負(fù)責(zé)維持低pH值，確保DNA維持不溶解的狀態(tài)。首先在溶解病毒顆粒的環(huán)節(jié)，以胍鹽溶解蛋白（病毒顆粒）的效率低于蛋白酶K消化蛋白（病毒顆粒），使得病毒RNA的釋放效率低了一級(jí)，其次又在苯酚萃取的環(huán)節(jié)，由于刻意的調(diào)低pH（目的是去掉DNA，個(gè)人認(rèn)為調(diào)高pH有助于病毒RNA的回收效率，畢竟宿主的DNA并不干擾病毒RNA的擴(kuò)增），導(dǎo)致一部分病毒RNA又隨著相間沉淀丟失了。兩個(gè)不利因素的累積，是Trizol試劑提取病毒RNA效率低的主要原因。

    其實(shí)Trizol試劑用作病毒RNA的提取，并非是最好的選擇，但優(yōu)點(diǎn)是幾乎所有的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室都能拿到。Trizol試劑用作新冠病毒RNA提取檢測(cè)時(shí)，靈敏度要達(dá)到10² copies/ml應(yīng)該是有困難的，如果用Trizol試劑檢測(cè)某些樣本的結(jié)果和本次實(shí)驗(yàn)相似（趴到的線），建議在Trizol試劑中補(bǔ)加Carrier RNA 以提高RNA提取效率，或者購(gòu)買病毒核酸純化試劑盒重測(cè)，以免漏檢或者誤判陽(yáng)性樣本。（當(dāng)然選病毒核酸純化試劑盒的時(shí)候也同樣關(guān)注是否有Carrier RNA，Carrier RNA 是高靈敏度試劑盒必備)。

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【以上文中實(shí)驗(yàn)所用Simgen Carrier RNA（Cat. No. 4003101）供貨于華大智造，是華大基因（華大智造）新冠病毒核酸檢測(cè)試劑盒配套試劑，同時(shí)也是生工sangon等廠家的 Carrier RNA 供應(yīng)商】

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Carrier RNA的存在對(duì)血漿游離核酸純化效率的影響

參考文獻(xiàn)

[1] nmdc.cn. (2019). 國(guó)家病原微生物資源庫(kù) 新型冠狀病毒核酸檢測(cè)引物和探針序列 信息來(lái)源：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心 病毒病預(yù)防控制所. [online] Available at: http://nmdc.cn/#/nCoV