前段時(shí)間，實(shí)驗(yàn)室的一瓶未使用過(guò)的 YPD 培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)染菌了，出現(xiàn)了一大朵類似蘑菇的真菌，形態(tài)奇異。想著好好的培養(yǎng)基不能白白浪費(fèi)了，要讓這偷吃的真菌付出代價(jià)，于是小新決定提取這個(gè)未知真菌DNA。（另外，對(duì)這種真菌有所了解的小伙伴可以在評(píng)論區(qū)留言，讓小新知道這個(gè)可惡的家伙叫什么。）
實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>
提取未知真菌的 DNA。
實(shí)驗(yàn)材料
1.未知真菌樣本；
3.電子恒溫不銹鋼水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）
4.旋渦振蕩器（越新儀器，XH-C）
5.臺(tái)式離心機(jī)（eppendorf Centrifuge 5415 D）
7.電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-6C 型）
實(shí)驗(yàn)步驟及結(jié)果
（一）DNA提取環(huán)節(jié)
眾所周知，真菌樣本因?yàn)槎嗵嵌喾拥奶匦?，核酸較難提取，所以本次實(shí)驗(yàn)使用植物/真菌 DNA 試劑盒提取未知真菌樣本的 DNA，具體操作步驟如下：
1.稱取 1500 mg 真菌于研缽中，加入 600 μl 65℃預(yù)熱的 Buffer PD 和 6 μl β-巰基乙醇，用力研磨至勻漿狀。
2.研磨充分后加入 2400 μl 65℃預(yù)熱的 Buffer PD，繼續(xù)研磨 1 分鐘，使組織完全裂解。（研磨到最后，研缽中還是存在較多細(xì)小顆粒狀物質(zhì)，無(wú)法被徹底研磨成勻漿。
3.轉(zhuǎn)移 800 μl 裂解產(chǎn)物至兩個(gè) 2 ml 離心管中，將離心管置于 65℃水浴 30 分鐘。水浴期間每隔 5~10 分鐘翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次以幫助 DNA 的釋放。
4.加入 800 μl Buffer EX，用力混合均勻，12000 rpm 離心 5 分鐘。
5.小心吸取 600 μl 上清，轉(zhuǎn)入一個(gè)新的 1.5 ml 管中。
6.在上清中加入等體積的 Buffer GP，混合均勻。
7.吸取 600 μl 步驟 6 中的混合液加入到核酸純化柱中，12000 rpm 離心 30 秒棄濾液。
8.將步驟 6 中剩余的混合液全部加入到核酸純化柱中，12000 rpm 離心 30 秒棄濾液。
9.在核酸純化柱中加入 500 μl Buffer WA，12000 rpm 離心 30 秒棄濾液。
10. 在核酸純化柱中加入 600 μl Buffer WB，12000 rpm 離心 30 秒棄濾液。
11. 14000 rpm 空離 1 分鐘。
12. 將核酸純化柱置于一個(gè)潔凈的 1.5 ml 離心管中，在純化柱中加入 200 μl 65℃預(yù)熱的 Buffer TE，蓋上管蓋，室溫靜置 2 分鐘，12000 rpm 離心 1 分鐘，洗脫得到 DNA。
13. 在超微量分光光度計(jì)上用 Buffer TE 調(diào)零，測(cè)量提取好的 DNA，結(jié)果如下：
表一：未知真菌提取的 DNA 濃度
14.在 1%的瓊脂糖凝膠上，加入 5 μl 提取到的 DNA，電泳 15 分鐘，結(jié)果下圖所示：
圖一
從濃度測(cè)量結(jié)果分析可知，植物/真菌 DNA 提取試劑盒成功提取出了未知真菌的 DNA，且濃度頗高。但是 A260/A280 比值達(dá)到 2.00，推測(cè)提取的 DNA 里面含有大量 RNA 或者降解的 DNA。經(jīng)電泳圖驗(yàn)證，確實(shí)存在大量拖帶，與測(cè)量所得數(shù)據(jù)相符合。
（二）DNA 處理純化環(huán)節(jié)
為了驗(yàn)證拖帶是 RNA 還是降解的 DNA，往提取的 DNA 中加入 0.5 μl RNaseA，37℃放置 1 小時(shí)，然后再用 DNA 純化試劑盒提取處理過(guò)的 DNA，具體步驟如下：
1.吸取 30 μl RNase A 處理過(guò)的 DNA 溶液，加入 5 倍體積的 Buffer P，直接用移液器吸打幾次混勻，將混合液轉(zhuǎn)移到核酸純化柱中。
2.12000 rpm 離心棄濾液。
3.在核酸純化柱中加入 700 μl Buffer WB，12000 rpm 離心棄濾液。
4.14000 rpm 空離 1 分鐘。
5.將核酸純化柱置于一個(gè)潔凈的 1.5 ml 離心管中，在純化柱的膜中央加入 30 μlBuffer TE，蓋上管蓋，室溫靜置 1 分鐘，12000 rpm 離心 30 秒洗脫 DNA。
6.在超微量分光光度計(jì)上用 Buffer TE 調(diào)零，測(cè)量提取好的 DNA，結(jié)果如下：
表二：經(jīng) RNase A 處理過(guò)的未知真菌的 DNA 濃度
7.在 1%的瓊脂糖凝膠上，加入 5 μl 提取到的 DNA 電泳 25 分鐘，結(jié)果如下圖：
圖二
對(duì)比表二和表一數(shù)據(jù)可以看到，經(jīng)過(guò)RNase A 處理后 DNA 溶液的濃度減少了 10 倍以上，說(shuō)明之前提取的 DNA 中含有大量的 RNA。從電泳圖可以看到，經(jīng)過(guò) RNase A 處理后，拖帶變少了，這是因?yàn)槠渲械拇罅?RNA 被降解去除了。但是拖帶情況仍舊存在，說(shuō)明其中含有一部分降解的 DNA。
討論與分析
1.本次實(shí)驗(yàn)成功提取到了未知真菌樣本的 DNA，從圖二可以明顯看到，雖然有部分降解，但提取的 DNA 主帶清晰可見(jiàn)。
2.對(duì)比樣本 1 和樣本 2 的數(shù)據(jù)可以看到，兩管樣本的 DNA 濃度相差了 2 倍左右，推測(cè)可能是因?yàn)檠心r(shí)該真菌樣本中存在較多的顆粒物質(zhì)，在提取步驟3 轉(zhuǎn)移到離心管時(shí)，第一個(gè)樣本吸取的大多是上清液，第 2 個(gè)樣本吸取了較多底部的這種顆粒，使得兩管樣本最后提取的 DNA 數(shù)據(jù)相差較大。
3.從表一和表二數(shù)據(jù)分析可知，該未知真菌提取的 DNA 中含有大量的 RNA，占了總濃度的 90%以上，相對(duì)來(lái)說(shuō) DNA 含量比較少，平均 500 mg 樣本中只有約 5.7 μg DNA。這也是真菌樣本（比如酵母）的共通點(diǎn)：DNA 含量較少而RNA 含量高，因此建議大家在提取真菌時(shí)盡可能的多加樣本，確保能提到足夠的 DNA，并且在提取步驟 3 中補(bǔ)加 RNase A 儲(chǔ)存液（Simgen Cat. No. 8001001）用以消化 RNA。
眾所周知，DNA 所包含的遺傳信息決定了不同種生物之間的差異，真菌也不例外。既然我們提取到了它的 DNA，就有可能通過(guò) DNA 分子來(lái)鑒定它到底是哪一類真菌，具體方法和結(jié)果敬請(qǐng)期待。
