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核酸純化柱的穩(wěn)定性測試方法

作者:新景實驗室
版權(quán)說明:本文系原創(chuàng)文章 轉(zhuǎn)載請標注出處和本文鏈接

前段時間有家做過濾器材的公司(后文簡稱A公司)找到我們,說是可以給我們提供核酸純化柱。雖然Simgen的核酸純化柱都是自產(chǎn)的,但是出于好奇,我們還是要了一些試用裝,測試它的核酸吸附效率以及穩(wěn)定性?,F(xiàn)在我們把測試方法分享給大家,作為核酸純化柱選擇的一個依據(jù)。

 

(一)實驗?zāi)康?/strong>

對比測試Simgen核酸純化柱和A公司核酸純化柱的性能。


(二)實驗材料與設(shè)備:

1. 新鮮培養(yǎng)的質(zhì)粒菌

2. 快速質(zhì)粒DNA小量試劑盒(Simgen Cat.No.1005050A公司提供的質(zhì)粒DNA純化柱

3. 臺式離心機(eppendorf Centrifuge 5415 D

4. 旋渦振蕩器(越新儀器,XH BH-C

5. 超微量分光光度計(Simgen Cat.No.Sim-100

6. 電泳儀(北京六一儀器廠,DYY-6C型 )

7. 電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司,DNP-9082

 

(三)實驗內(nèi)容:

1. 12000 rpm離心30秒收集53 ml過夜培養(yǎng)的細菌,棄盡培養(yǎng)基。加入250 μl已加入RNase A Buffer I,充分懸浮沉淀的細菌。

2. 加入250 μl Buffer II,溫和并充分地翻轉(zhuǎn)離心管4-6次。

3. 加入350 μl Buffer N8,溫和并充分地翻轉(zhuǎn)離心管直至溶液中殘留的藍色沉淀全部消失,轉(zhuǎn)變?yōu)榈S色沉淀。

4. 13200 rpm離心2分鐘。

5. 將所有上清液倒入50 ml離心管中,混合均勻,各取2Simgen公司和A公司的核酸純化柱置于2 ml離心管中,吸取800 μl混勻的上清液加入到各個核酸純化柱中,蓋上管蓋,12000 rpm離心30秒。

6. 2 ml離心管中的濾液,將核酸純化柱置回到2 ml離心管中,在核酸純化柱中加入800 μl Buffer W2,蓋上管蓋,12000 rpm離心30秒。

7. 2 ml離心管中的濾液,將核酸純化柱置回到2 ml離心管中,最高速13200 rpm離心1分鐘。

8. 2 ml離心管,將核酸純化柱置于一個潔凈的1.5 ml離心管中,在純化柱的膜中央加入60 μl Buffer E,蓋上管蓋,室溫靜置1分鐘,12000 rpm離心30秒。

9. 在超微量分光光度計上測量洗脫的質(zhì)粒DNA的濃度并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

10. 各取10Simgen公司和A公司的核酸純化柱,在50℃恒溫箱中放置7天,7天后各取出2個核酸純化柱,再加上2Simgen公司同一批的未放入恒溫箱的純化柱,按步驟1-9再測試一遍。

 

(四)實驗結(jié)果:

1. 在超微量分光光度計上用Buffer E調(diào)零,測量洗脫的質(zhì)粒DNA,結(jié)果如下:

 快速質(zhì)粒DNA小量試劑-Sim-100超微量分光光度計-質(zhì)粒純化柱 Ⅱ-實驗結(jié)果圖

樣本編號0為常溫放置7天的Simgen核酸純化柱,樣本編號150℃放置7天的Simgen核酸純化柱,樣本編號250℃放置7天的A公司核酸純化柱。 


2. 1%的瓊脂糖凝膠上,加入5 μl提取到的質(zhì)粒DNA,電泳20
分鐘,結(jié)果如下:
 快速質(zhì)粒DNA小量試劑-Sim-100超微量分光光度計-質(zhì)粒純化柱 Ⅱ-電泳結(jié)果圖



(五)實驗討論與分析:

1. 結(jié)合表1和圖1分析可知,未經(jīng)恒溫箱放置前,兩公司的核酸純化柱對質(zhì)粒DNA的吸附效率無明顯差異。

2. 結(jié)合表2和圖2分析可知,Simgen核酸純化柱在50℃放置7天后核酸吸附效未受影響,與室溫放置的對照組吸附效率無明顯差異,而A公司的核酸純化柱在50℃放置7天后核酸吸附效果明顯變差,吸附效率只有原來的30%

3. 作為柱式核酸純化試劑盒中的核酸純化柱,其重要性往往被忽略,甚至是國際巨頭Qiagen公司也栽過跟頭,曾經(jīng)要求用戶將柱子放到2~8℃儲存,以免影響其回收效率。所以測試純化柱穩(wěn)定性的方法也很簡單,只要將純化柱在高于常溫的條件下放置一段時間,就能辨別出柱子的穩(wěn)定性差異。國內(nèi)的T**ngen、O**ga等廠家的一些試劑盒要求用戶在使用前用平衡液洗滌純化柱,其本質(zhì)就是純化柱穩(wěn)定性有缺陷所導(dǎo)致的。所以用戶在大量選購純化柱時務(wù)必要做一下純化柱的穩(wěn)定性測試,如果不巧是選用了來源不明的核酸純化柱(特別是沒有核酸純化技術(shù)累積的公司),為了保險起見,最好是放到2~8℃儲存。



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