分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)過程中會需要用到各種各樣的耗材，比如離心管、移液器吸頭、各類試劑瓶和凍存管等，有些實(shí)驗(yàn)對耗材的要求比較高，比如RNA實(shí)驗(yàn)中會要求耗材必須是RNase-free的，細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中會要求耗材是無細(xì)菌內(nèi)毒素的。

小新之前購買濾芯吸頭的時(shí)候咨詢過幾個(gè)廠家，當(dāng)問到吸頭是否是DNase-free/RNase-free時(shí)他們都會說是的，但是當(dāng)問到他們有沒有檢測過、是否有COA時(shí)，這幾個(gè)廠家要么就直接說沒有，要么就直接不說話了。這是因?yàn)楹芏嗪牟纳a(chǎn)廠家并不具備這方面的相關(guān)知識，沒有這方面的意識；也有一部分廠家雖然了解這方面的知識，也在生產(chǎn)過程中進(jìn)行了控制，保證生產(chǎn)的耗材是DNase-free/RNase-free的，但是卻缺少檢測手段或檢測條件，無法讓客戶信任。

正好前段時(shí)間有個(gè)耗材廠家找到我們，想讓我們幫忙檢測他們生產(chǎn)的耗材是否有DNase、RNase、細(xì)菌內(nèi)毒素殘留，今天小新就把檢測的方法分享給大家。

一、檢測材料

待測吸頭、待測容器

無酶無內(nèi)毒素吸頭及耗材：1 ml濾芯吸頭（Axygen，TF-1000-R-S），200 μl濾芯吸頭（Axygen，TF-200-R-S），10 μl濾芯吸頭（Axygen，TF-300-R-S），1.5 ml離心管（Axygen，MCT-150-C）

DL2000 Ladder（Simgen Cat.No.MD1006）

DNA純化試劑盒（Simgen Cat.No.2101050）

DNase Ⅰ（Simgen Cat.No.8003050）

6×Loading Buffer（Simgen Cat.No.9008005）

ddH₂O

Carrier RNA（干粉，Simgen Cat.No.4003201）

RNase A（Simgen Cat.No.8001001）

DEPC處理ddH₂O

無內(nèi)毒素水（細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水）

細(xì)菌內(nèi)毒素（15 EU）

鱟試劑（快速凝膠法λ=0.25 EU/mL）

電熱恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9082，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）

電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-6C型）

二、檢測方法

（一）DNase檢測

1. 配置1%瓊脂糖凝膠待用；

2. 將DL2000 Ladder用DNA純化試劑盒清潔回收，去除DNaseⅠ消化抑制物；

3. 設(shè)置陽性對照2組，陰性對照2組，測試樣本n組（在確定無酶的離心管中配制）：

陽性：8份清潔后的DL2000 Ladder+1份10×DNase Buffer +1份DNaseⅠ；

陰性：8份清潔后的DL2000 Ladder+1份10×DNase Buffer +1份ddH₂O；

測試樣品：8份清潔后的DL2000 Ladder+1份10×DNase Buffer +1份ddH₂O；

4. 測試吸頭類：用待測吸頭吹吸步驟3中的測試樣品組溶液10次混勻；

測試容器類：在待測容器里加入步驟3中的測試樣品組溶液，使用配套設(shè)備（蓋子、封口膜等）密封，振蕩混勻15 s后靜置1 min，離心1000 rpm 10 s；

5. 將3組反應(yīng)液放置37℃消化1 h；

6. 加入6×Loading Buffer，電泳30 min。

（二）RNase檢測

1. 用DEPC處理ddH₂O配置1%瓊脂糖凝膠待用；

2. 用1.5 ml DEPC處理ddH₂O溶解干粉Carrier RNA，濃度大約206 ng/μL；

3. 設(shè)置陽性對照2組、陰性對照2組、測試樣本n組（在確定無酶的離心管中配制）：

陽性：1 份RNase A+9份Carrier RNA

陰性：1 份DEPC處理ddH₂O+9份Carrier RNA

測試樣品：1份DEPC處理ddH₂O+9份Carrier RNA

4. 測試吸頭類：用待測吸頭分別吹吸步驟3中的測試樣品組溶液10次混勻；

測試容器類：在待測容器里加入步驟3中的測試樣品組溶液，使用配套設(shè)備（蓋子、封口膜等）密封，振蕩混勻15 s后靜置1 min，離心1000 rpm 10 s；

5. 將3組反應(yīng)液放置37℃消化30 min；

6. 加入6×Loading Buffer，電泳15 min。

（三）內(nèi)毒素檢測

1. 細(xì)菌內(nèi)毒素每瓶加1 ml無內(nèi)毒素水溶解，振蕩混勻15 min，然后用無內(nèi)毒素水稀釋到1 EU/ml，振蕩混勻15 s備用（4℃可保存4小時(shí)）；

2. 測試吸頭類：吸取適量無內(nèi)毒素水于明確無內(nèi)毒素的離心管中，用待測吸頭吹吸10次混勻得到提取液，吸取或合并提取液至100 μl進(jìn)行測試，10 min內(nèi)使用；

測試容器類：容器里加入適量無內(nèi)毒素水（10-100 μl，不宜過多），使用配套設(shè)備（蓋子、封口膜等）密封，振蕩混勻15 s后得到提取液，吸取或合并提取液至100μl進(jìn)行測試；

3. 向鱟試劑安瓿瓶中加100 μl無內(nèi)毒素水，輕輕振蕩使鱟試劑完全溶解（注意不要產(chǎn)生氣泡，即用即配），按下列分組進(jìn)行測試：

陽性：取2支鱟試劑加入100 μl步驟1的細(xì)菌內(nèi)毒素；

陰性：取1支鱟試劑加入100 μl無內(nèi)毒素水；

測試樣品：取n支鱟試劑加入100 μl步驟2的提取液；

4. 封口后放入恒溫箱37℃靜置60 min±2 min，避免振動；

5. 靜置完畢后，輕輕取出鱟試劑，緩慢倒轉(zhuǎn)180°，判斷是否有內(nèi)毒素殘留。

三、結(jié)果判定

1. DNase檢測電泳結(jié)果如下：

若如圖一所示，陰性對照及檢測樣品DNA條帶清晰，亮度相同，陽性對照無DNA條帶，則說明檢測的樣品是DNase-free的。

2. RNase檢測電泳結(jié)果如下：

若如圖二所示，陰性對照及檢測樣品RNA條帶清晰，亮度相同；陽性對照無RNA條帶，則說明檢測的樣品是RNase-free的。

3. 內(nèi)毒素檢測結(jié)果如下：

+：內(nèi)容物呈堅(jiān)實(shí)凝膠，不變形不從管壁滑脫；

-：不呈凝膠或雖生成凝膠但不能保持完整并從管壁滑脫。

若陽性為“+”，陰性和檢測樣品為“-”，則說明檢測的樣品無內(nèi)毒素或內(nèi)毒素低于檢出下限。

如果小伙伴們在實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)問題，懷疑是使用耗材所導(dǎo)致的，可以參考小新的方法對耗材進(jìn)行檢測，或者直接從有檢測報(bào)告或者COA的廠家采購耗材。