近日來(lái)，公司再次接到凝膠回收效率低的反饋，經(jīng)過(guò)深入探究客戶反映的問(wèn)題，小編發(fā)現(xiàn)很多用戶都是將擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)濃度后估算回收效率的，并且回收的DNA濃度也各不相同，于是設(shè)計(jì)一系列相關(guān)模擬實(shí)驗(yàn)，如下：

用于回收DNA的樣本：

1. 陳舊細(xì)菌細(xì)胞中提取的pMD18 的單酶切產(chǎn)物，含部分降解的DNA，用以模擬含有部分引物二聚體或有非特異擴(kuò)增的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如下圖

2. 經(jīng)過(guò)DNA純化試劑盒（Simgen Cat.No. 2101050）純化后的陳舊細(xì)菌細(xì)胞中提取的pMD18 的單酶切產(chǎn)物；

3. 正常pMD18的單酶切產(chǎn)物，只有單條帶的DNA，用以模擬只有特異性擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；

4. 經(jīng)過(guò)DNA純化試劑盒（Simgen Cat.No. 2101050）純化后的正常pMD18 的單酶切產(chǎn)物；

實(shí)驗(yàn)設(shè)備：

臺(tái)式小量離心機(jī)、水浴鍋、電泳設(shè)備、恒溫培養(yǎng)箱、Sim-100微量紫外分光光度計(jì)。

實(shí)驗(yàn)方法：

此實(shí)驗(yàn)分兩批進(jìn)行：

第一批是陳舊細(xì)菌細(xì)胞中提取的pMD18 的單酶切產(chǎn)物及其純化產(chǎn)物為樣本，

第二批是正常pMD18 的單酶切產(chǎn)物及其純化產(chǎn)物為樣本。

將酶切產(chǎn)物及酶切純化產(chǎn)物按2μg、1μg、500ng及100ng上樣量電泳后做DNA凝膠回收（試劑盒為Simgen Cat.No. 2001050）實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組分A組（純化前酶切產(chǎn)物）、B組（純化后酶切產(chǎn)物），C組（對(duì)照組，按B組設(shè)計(jì)的DNA加入量，與150μl融化的瓊脂糖凝膠混合，冷卻凝固后作為無(wú)損失的含DNA凝膠塊）。

樣本電泳加樣順序：

將A、B、C 三組按照凝膠DNA回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，所回收的DNA用25μl Buffer TE洗脫，并測(cè)OD值。

實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果如下：

從上表結(jié)果可分析得到：

1.  100 ng上樣量的回收率有很大跳動(dòng)，甚至有的看似回收率超過(guò)100%，估計(jì)是因?yàn)樵?/span>DNA濃度過(guò)低（<10ng/μl）時(shí)，分光光度計(jì)測(cè)到的OD值會(huì)出現(xiàn)很大的偏差，因此100 ng上樣量測(cè)得的回收率不能作為有效的分析數(shù)據(jù)。

2.  實(shí)驗(yàn)組中拖尾pMD18單酶切產(chǎn)物的回收率均低于正常pMD18單酶切產(chǎn)物，可以解釋為陳舊樣本中所含的小片段降解DNA，在切膠時(shí)這些拖尾帶未被切下，造成了DNA的損失；

3.  實(shí)驗(yàn)組中純化前樣本的回收率均低于純化后樣本。是因?yàn)槊盖泻笕芤褐杏薪M份（比如水解后的單核苷酸）提高了OD260的吸光度，因而純化后的DNA樣本的OD260的吸光度更為真實(shí)。

最后我們可以得出結(jié)論：

1. 以OD260的吸收值來(lái)判定凝膠DNA回收試劑盒的回收效率并不科學(xué)，因?yàn)橛泻芏嘁蛩貢?huì)影響OD值，如PCR體系中的多余引物、dNTPS及非特異擴(kuò)增產(chǎn)物等。

2. 如果要精確測(cè)試凝膠DNA回收試劑盒回收效率，應(yīng)先確保DNA樣本中沒(méi)有其他雜質(zhì)或核酸干擾OD260的吸收值。

3. DNA上樣量不能過(guò)低，如果有可能，應(yīng)將全部的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上樣電泳，否則分光光度計(jì)在測(cè)試10ng/μl以下濃度的核酸時(shí)，計(jì)算回收率時(shí)會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的偏差。