質(zhì)粒DNA的提取是分子生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的必備實(shí)驗(yàn)技能，市場(chǎng)中有許多質(zhì)粒DNA提取的試劑盒，但是你是否想過(guò)自己動(dòng)手制作一個(gè)質(zhì)粒DNA試劑盒呢？這次就由小編來(lái)教大家怎樣利用實(shí)驗(yàn)室常用資源來(lái)制作一個(gè)高純高效的柱純化質(zhì)粒DNA試劑盒。

第一，所在實(shí)驗(yàn)室必須擁有這些常用試劑：葡萄糖、Tris、HCl、EDTA、NaOH、SDS、乙酸鉀、冰乙酸、無(wú)水乙醇、異丙醇和超純水；

第二，利用這些試劑配制質(zhì)粒DNA提取所需的溶液：

堿裂解溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl（pH8.0），10mM EDTA（pH8.0）;

堿裂解溶液Ⅱ：0.2M NaOH，1%（m/v） SDS;

堿裂解溶液Ⅲ（100ml）：5M 乙酸鉀 60ml，冰乙酸  11.5ml，純水28.5ml;

70%乙醇（50ml）：35ml無(wú)水乙醇加15ml超純水

    第三，我們可以去淘寶上購(gòu)買質(zhì)粒DNA純化柱（simgen，7002050）、RNase A（simgen，8001-001）。

所需的試劑都準(zhǔn)備齊了，接下來(lái)，小編教大家怎樣利用這些資源來(lái)提取質(zhì)粒DNA：

1. 收集細(xì)菌，用1.5ml離心管收集1-5ml過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌；

2. 向離心管中加入250μl堿裂解溶液Ⅰ懸浮細(xì)菌（漩渦振蕩或移液器吹打）；

3. 接著向溶液中加入250μl堿裂解溶液Ⅱ裂解細(xì)菌（溫和上下顛倒離心管數(shù)次）；

4. 接著再向溶液中加入250μl堿裂解溶液Ⅲ中和溶液（溫和上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次）；

5. 13000rpm高速離心10min，取上清至另一潔凈的離心管中；

6. 向溶液中加入275μl的異丙醇，混勻（溫和上下顛倒離心管數(shù)次或移液器吹打數(shù)次）；

7. 將溶液全部轉(zhuǎn)至純化柱中（由于體積過(guò)大，溶液分兩次過(guò)柱）；

8. 12000rpm高速離心30s，棄濾液；

9. 向純化柱中加入70%的乙醇；

10. 12000rpm高速離心30s，棄濾液；

11. 13000rpm高速離心2min，將純化柱置于潔凈的離心管；

12. 向純化柱中加入60μl超純水（雙蒸水），靜止2min;

13. 12000rpm高速離心30s，洗脫即可得到高純質(zhì)粒DNA。

注意事項(xiàng)：

1. 此實(shí)驗(yàn)自制質(zhì)粒DNA試劑盒所用的純化柱和RNase A均是使用simgen的產(chǎn)品，倘若使用其他公司或其他序號(hào)的產(chǎn)品，可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)變化；

2. 在實(shí)驗(yàn)前將RNase A加到堿裂解溶液Ⅰ中，濃度是100μg/ml;

3. 加入堿裂解溶液Ⅱ后應(yīng)馬上翻轉(zhuǎn)且這步不能超過(guò)5min;

4. 異丙醇的體積不要太大，否則會(huì)有大量RNA殘留。

    為了檢測(cè)自制的質(zhì)粒DNA試劑盒的性能，小編用1個(gè)快速質(zhì)粒DNA試劑盒產(chǎn)品（simgen）來(lái)做對(duì)照，所得的質(zhì)粒DNA的詳細(xì)OD值見(jiàn)下表：

1、2為對(duì)照試劑盒提取得到的質(zhì)粒DNA，3、4為自制試劑盒提取得到的質(zhì)粒DNA。

電泳結(jié)果圖：

從OD值和電泳圖可以看出，自制的質(zhì)粒DNA試劑盒所提取的DNA在濃度上和RNA殘留量都和對(duì)照的質(zhì)粒DNA試劑盒相似，并無(wú)明顯的差異，而且自制的試劑盒所提取的DNA的鹽分殘留更少。

好了，今天的新景生物實(shí)驗(yàn)室：分子生物百科就到這里了。大家覺(jué)得感興趣的話，可以自己動(dòng)手試試哦，我們下期再見(jiàn)?。?/span>

                                                2016年3月23日

                                                新景生物實(shí)驗(yàn)室