一、材料：

1. 樣品：

由廈門**商貿(mào)有限公司提供。

2. 動物組織DNA試劑盒（Simgen，Cat.No.3101050）

4. PCR擴增試劑、引物、探針為杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司自配或委托上海**生物技術(shù)有限公司合成。

5. PCR儀：ABI PRISM® 7500 Sequence DeteCtion System

6. 離心機：Thermo Biofuge pico

二、方法：

1. 用Simgen動物組織DNA試劑盒分離純化魚排粉中的DNA。

2. 按下列組分配制PCR檢測試劑( 40 μl反應(yīng)體系)：

Master Mix(2×)              20.0 μl

上游引物FP                1.0 μl

下游引物RP                1.0 μl

探針Probe                  0.5 μl

50× ROX                   0.8μl

ddH₂O                     11.7 μl

向每個PCR反應(yīng)管中加入35 μl反應(yīng)混合液，再加入5μl分離純化的DNA進行RT-PCR檢測。

注：陽性對照用雞DNA作為模板，陰性對照用ddH₂O作為模板。

3. PCR循環(huán)條件設(shè)置： 95℃ 1min→40×（95℃ 15s→60℃ 30s）

三、結(jié)果判定：

1．有效性原則

陰性對照：無FAM熒光信號檢出，未出現(xiàn)典型的擴增曲線。

陽性對照：有FAM熒光信號檢出，并出現(xiàn)典型的擴增曲線。

以上要求必須同時滿足，否則本次檢測無效。

結(jié)果：

1. 送檢的樣品檢測到雞源DNA組分。

2. 結(jié)果分析：

①　送檢樣品和陽性對照均起線，陰性對照未起線，陽性對照CT值為15.213，送檢樣品CT值分別為32.681,33.385。故所檢測魚排粉樣品中含有雞源DNA。

②　注意：本基因檢測僅能檢測到雞源DNA組分，不能檢測到其他鳥類的DNA組分，即樣品中若含有鴨、鵝等DNA組分，也是無法檢測出的。

Ct值報告截圖如下：

熒光PCR擴增曲線截圖如下：