一、材料：

1. 樣品：送檢尾部組織樣本由客戶提供。

2. 動物組織DNA試劑盒（Simgen，Cat.No.3101050）

3. PCR擴(kuò)增試劑、引物、探針為杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司自配或委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

4. PCR儀：ABI PRISM® 7500 Sequence DeteCtion System

5. 離心機(jī)：Thermo Biofuge pico

二、方法：

1. 用Simgen動物組織DNA試劑盒分離純化樣本中的DNA。

2. 按下列組分配制PCR檢測試劑( 40 μl反應(yīng)體系)：

Master Mix(2×)              20.0 μl

上游引物FP                1.0 μl

下游引物RP                1.0 μl

探針Probe                  0.5 μl

50× ROX                   0.8μl

ddH₂O                     11.7 μl

向每個PCR反應(yīng)管中加入35 μl反應(yīng)混合液，再加入5μl分離純化的DNA進(jìn)行qPCR檢測。

注：陽性對照用實驗室保藏的小鼠肌肉DNA作為模板，陰性對照用ddH₂O作為模板。

3. PCR循環(huán)條件設(shè)置： 95℃ 1 min→40×（95℃ 15s→60℃ 30s）

三、結(jié)果判定：

1．有效性原則

陰性對照：無FAM熒光信號檢出，未出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。

陽性對照：有FAM熒光信號檢出，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。

以上要求必須同時滿足，否則本次檢測無效。

結(jié)果：

1. 送檢樣本中的尾部組織DNA通過鼠的特異性熒光探針擴(kuò)增檢測呈陽性，判斷樣本的物種為鼠。

2. 結(jié)果分析：

1） 本次尾部組織樣本提取了兩管DNA，編號為Sample 1和Sample 2，經(jīng)PCR擴(kuò)增均為陽性，Ct值分別為16.105和16.524，陽性對照的Ct值分別為16.358和16.596，陰性對照未起線。

2） 從樣本DNA電泳發(fā)現(xiàn)，樣本的DNA保存較為完整，應(yīng)該是尾部組織水分少，腐敗情況不嚴(yán)重。

 送檢動物尾部組織樣本的Ct值報告：

送檢動物尾部組織樣本的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線：

送檢動物尾部組織樣本DNA電泳圖：

如圖所示，其中M為DL2000Marker, 泳道1、2為送檢樣本DNA，泳道3、4是實驗室保藏的小鼠肌肉組織DNA。